熒光實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌KatG基因突變的研究.pdf

1、結(jié)核病(t,ubcrculosis，TB)是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的全球性傳染病。近年來(lái)，全球結(jié)核病疫情正在回升，結(jié)核病依然是一個(gè)嚴(yán)重的、需要高度重視的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題。異煙肼(isoniazid，INH)作為抗結(jié)核主要的一線(xiàn)藥物，結(jié)核分枝桿菌對(duì)其耐藥性的問(wèn)題倍受關(guān)注。耐藥結(jié)核分枝桿菌，特別是多重耐藥結(jié)核分枝桿菌的增加，嚴(yán)重影響了結(jié)核病的治療，給結(jié)核病控制帶來(lái)了極大的困難。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)是建立在生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的表型上，這種方法所需時(shí)間長(zhǎng)

2、，通常為1～2個(gè)月，不能滿(mǎn)足現(xiàn)代短程化療的需求。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制逐步被闡明，盡管結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼的分子機(jī)制尚未完全闡明，但至今研究結(jié)果均表明，INI耐藥與結(jié)核分枝桿菌的KatG基因突變的聯(lián)系最強(qiáng)，其中S315T位點(diǎn)的點(diǎn)突變是結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼的主要原因。結(jié)核分枝桿菌KatG基因的編碼序列(CDS)長(zhǎng)度為2223bp，編碼產(chǎn)物為過(guò)氧化氫酶一過(guò)氧化物酶。因此，建立一種對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的快速篩

3、查方法，為盡快制定最佳治療方案，防止耐藥菌株在人群中的擴(kuò)散，是臨床需要迫切解決的問(wèn)題。目前，針對(duì)KatG S315T位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)研究的方法較多，如PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、直接測(cè)序法、雙脫氧指紋圖法、異源雙鏈形成法、反向系列探針雜交法、DNA微陣列分析以及噬菌體生物擴(kuò)增法等。這些方法或者由于技術(shù)的原因，存在假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果，或者需要較為特殊的儀器和試劑盒，試驗(yàn)費(fèi)用較昂貴，很大程度限制了在臨床實(shí)驗(yàn)室大

4、規(guī)模推廣使用。為此，本研究的主要目的為：建立以熒光實(shí)時(shí)PCR為基礎(chǔ)的TaqMan熒光探針?lè)焖贆z測(cè)結(jié)核分枝桿菌KatG S315T基因突變，探討該方法能否作為臨床上一種新的分子藥敏試驗(yàn)方法，用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的敏感性，為臨床早期治療提供快速而準(zhǔn)確可靠的方法及依據(jù)，并評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值。 材料與方法： 菌株來(lái)源：103株實(shí)驗(yàn)菌株包括61株異煙肼耐藥株(其中高濃度耐藥株49株，低濃度耐藥株12株)和42株異煙肼敏感

5、株。42株異煙肼敏感株和大部分異煙肼耐藥菌株均來(lái)源于江門(mén)市結(jié)核病防治所，部分異煙肼耐藥株來(lái)源于廣州市胸科醫(yī)院，結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC 27294)購(gòu)自衛(wèi)生部國(guó)家菌種保存中心。所有103株實(shí)驗(yàn)菌株均鑒定為結(jié)核分枝桿菌。 方法：應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)PCR TaqMan熒光探針?lè)ê虳NA序列分析分別對(duì)臨床分離的61株結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥株(其中高濃度耐藥株49株，低濃度耐藥株12株)和42株結(jié)核分枝桿菌異煙肼敏感株進(jìn)行Ka

6、tGS315T基因突變檢測(cè)。將熒光實(shí)時(shí)PCR TaqMan熒光探針?lè)ńY(jié)果與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)熒光實(shí)時(shí)PCR TaqMan熒光探針?lè)z測(cè)KatG S315T基因突變的準(zhǔn)確度，分析KatG S315T基因突變與耐藥的關(guān)系，并且與絕對(duì)濃度法(間接法)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)二者的一致性。 結(jié)果： 42株異煙肼敏感株DNA序列分析均沒(méi)有檢測(cè)到KatG S315T基因突變，在61株異煙肼耐藥株中，檢測(cè)到50株存在KatG S

7、315T基因突變，1株存在Ser315Arg(AGC→AGA)的突變，1株發(fā)生Val319Asp(GTC→GAC)突變，突變率為85.2％(52／61)。其中高濃度耐藥株中有46株檢出發(fā)生S315T突變，1株發(fā)生Val319Asp突變，突變率為5.9％(47／49)；低濃度耐藥株中有4株檢出發(fā)生S315T突變，1株發(fā)生Ser315Arg(AGC→AGA)的突變，突變率為41.7％(5／12)，高濃度耐藥株的基因突變率遠(yuǎn)高于低濃度耐藥株的

8、基因突變率(P<0.01)；42株異煙肼敏感株熒光實(shí)時(shí)PCR TaqMan熒光探針?lè)z測(cè)均無(wú)KatG S315T基因突變，61株異煙肼耐藥株中有49株存在KatG S315T基因突變，其中高濃度耐藥株48株，低濃度突變株1株；熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)KatG S315T基因突變的結(jié)果和測(cè)序法結(jié)果一致的有100株， 因此，與DNA序列分析相比，熒光實(shí)時(shí)PCR TaqMan熒光探針?lè)z測(cè)的準(zhǔn)確率為97.1％(100／103)。 熒光實(shí)時(shí)

9、PCR TaqMan熒光探針?lè)z測(cè)的靈敏度為80.3％(49／61)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100％(49／49)，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果；特異度100％，陰性預(yù)測(cè)值為77.8％(42／54)，假陰性率為19.7％(12／61)，103株實(shí)驗(yàn)菌株中，91株的檢測(cè)結(jié)果和絕對(duì)濃度法(間接法)藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符合，符合率為88.3％(91／103)。 結(jié)論： 本研究采用熒光實(shí)時(shí)PCR TaqMan熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)核分枝桿菌KatG S315T基因突