家蠶類胰島素相關(guān)肽結(jié)合蛋白2的功能分析及其互作蛋白的鑒定.pdf

1、家蠶是鱗翅目昆蟲的模式生物，也是重要的遺傳研究模型。家蠶質(zhì)型多角體病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是家蠶主要病毒病原之一，可以引起家蠶群體內(nèi)中腸型膿病的發(fā)生。迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)家蠶對BmCPV的防御機制的研究報道較少，養(yǎng)蠶生產(chǎn)上對中腸型膿病的防治也僅是以預(yù)防為主。不同家蠶品種對BmCPV感染的抵抗性有一定的差異，但尚未培育出抗BmCPV的家蠶品種。為了從分子水平上

2、探索家蠶抵抗BmCPV感染的防御機制和不同家蠶品種對BmCPV的免疫調(diào)控機理，我們前期通過高通量測序技術(shù)分析篩選了家蠶品種4008（BmCPV易感）和P50（BmCPV抗性）在感染BmCPV后的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)家蠶中腸的類胰島素相關(guān)肽結(jié)合蛋白2（Bombyx mori insulin-related peptide-binding protein,BmIBP2）基因的表達水平明顯上調(diào)，且在抗性品種中的上調(diào)表達倍數(shù)高于易感品種，生物信息

3、學(xué)分析推測IBP基因與細胞凋亡及免疫防御有關(guān)，因此推測BmIBP2參與了家蠶抵抗BmCPV感染的防御機制。本研究成功表達了BmIBP2的重組蛋白rBmIBP2，研究該蛋白對家蠶細胞增殖的影響，并采用RNA干涉及過表達技術(shù)研究了BmIBP2基因的功能，進一步鑒定獲得一個BmIBP2的互作蛋白。得到的主要實驗結(jié)果如下：
　　1.BmIBP2基因在BmCPV和其它幾種病原侵染家蠶中腸中的差異表達
　　通過實時熒光定量PCR（qRT

4、-PCR）技術(shù)檢測了家蠶感染質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）、核型多角體病毒（BmNPV）、二分濃核病毒（BmBDV）、球孢白僵菌（Beauveria bassina）、家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）后不同時間點中腸組織中BmIBP2的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmIBP2基因不僅在BmCPV感染的家蠶中腸上調(diào)表達，在其他病原感染的家蠶中腸，也發(fā)生一定的差異表達，說明該基因參與了家蠶對病原感染的應(yīng)答與防御過程，并且具有重要的免疫防御

5、功能。
　　2.BmIBP2蛋白對家蠶培養(yǎng)細胞增殖的影響
　　首先通過原核表達系統(tǒng)對BmIBP2基因進行重組表達，對表達的重組蛋白進行純化復(fù)性后添加入家蠶BmN細胞培養(yǎng)基中，通過MTT法檢測該純化蛋白對BmN細胞增殖的影響，并檢測了蛻皮激素20E對BmIBP2基因的調(diào)控作用。結(jié)果表明，純化的重組蛋白rBmIBP2對家蠶BmN細胞的增殖具有一定的抑制作用，并且20E能夠促進家蠶細胞中BmIBP2的表達。
　　進一步通過R

6、NAi和基因過表達技術(shù)探索了BmIBP2基因的功能。采用化學(xué)合成法合成了BmIBP2基因的siRNA及negative control siRNA，轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞，檢測其對細胞增殖的影響，同時檢測BmIBP2基因及糖代謝相關(guān)呼吸酶基因的表達變化情況。RNAi實驗結(jié)果顯示，BmIBP2基因被干擾沉默后，與對照組相比，BmIBP2基因呈現(xiàn)下調(diào)表達，家蠶BmN細胞增殖速度加快，同時檢測到糖代謝相關(guān)呼吸酶基因呈現(xiàn)上調(diào)表達。同時，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)

7、基因表達載體pIZT-IBP2對BmIBP2基因進行過表達，實驗結(jié)果顯示，與對照組相比家蠶BmN細胞增殖速度減慢，并且糖代謝呼吸酶相關(guān)基因呈現(xiàn)下調(diào)表達。
　　3.BmIBP2互作蛋白的篩選與鑒定
　　利用Bac-to-Bac表達系統(tǒng)將BmIBP2和EGFP在家蠶細胞中進行融合表達，其中EGFP基因作為報告基因，經(jīng)同源重組獲得vBmEGFP-IBP2重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染家蠶細胞并用SDS-PAGE和Western-blo

8、t方法檢測重組蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白成功表達，大小約為55kDa。隨后收集蛋白并利用EGFP作為抗原決定簇通過免疫共沉淀技術(shù)篩選與BmIBP2蛋白相互作用的宿主細胞蛋白。通過免疫共沉淀實驗，我們篩選到一個與BmIBP2有相互作用的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為家蠶ATP合成酶（Bombyx mori ATP synthase）。經(jīng)酵母雙雜交實驗驗證，家蠶類胰島素相關(guān)肽結(jié)合蛋白2與家蠶ATP合成酶之間的確存在相互作用。
　　上述研究結(jié)果不