家蠶胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白的表達(dá)和功能分析.pdf

1、胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白(cellular retinoic acid binding protein，CRABP)是胞內(nèi)脂結(jié)合蛋白的一種，與維甲酸(retinoic acid，RA)的生物學(xué)功能密切相關(guān)。維甲酸是一種重要的信號分子，能通過調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。在脊椎動物中存在兩類CRABPs，它們能促進(jìn)維甲酸的降解或轉(zhuǎn)運(yùn)維甲酸到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。 我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中獲得一

2、條cDNA序列，序列比對后推測可能是家蠶維甲酸結(jié)合蛋白基因，并首次研究了該蛋白的功能。通過RT-PCR的方法獲得了該基因的ORF并與NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，該ORF序列與家蠶CRABP mRNA的同源性為100﹪，與其它幾種無脊椎動物中CRABP的mRNA同源性為85﹪，因此我們認(rèn)為此cDNA為BmCRABP (Rombyxmorti cellular retinoic acid binding protein)基因，G

3、enBank登錄號為EF112401。該基因編碼132個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與無脊椎動物中該蛋白的氨基酸序列同源性較高(達(dá)90﹪)。根據(jù)序列比對的結(jié)果和1CRABP-Ⅰ，CRABP-Ⅱ的氨基酸序列中對配體結(jié)合起重要作用的氨基酸推測BmCRABP的關(guān)鍵氨基酸可能是：D73、K79、D99。BmCRABP關(guān)鍵氨基酸的性質(zhì)與CRABP-Ⅰ的比較相近，因此，推測BmCRABP的功能可能也與脊椎動物CRABP-Ⅰ的相類似，即BmCRABP與RA的

4、降解有關(guān)。 為了研究BmCRABP的功能，將該基因的ORF克隆到載體pET-28a(+)中，重組成功原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-CRABP，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E．coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE檢測，與陰性對照相比在18kDa處有一特異性條帶，與預(yù)期值相符。重組蛋白以可溶的形式表達(dá)，通過分子篩和親和層析純化了重組蛋白，并使用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，效價(jià)大于1∶12800。

5、 生物信息學(xué)分析推測BmCRABP可能與RA的降解有關(guān)，因此我們研究了BmCRABP和全反式維甲酸(a11-trans retinoic acid，atRA)的關(guān)系。首先，我們重組了真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Cl-CRABP，并用BmCRABP的ORF制備了RNAi用的dsRNA，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞Bm5后，細(xì)胞會過量表達(dá)CRABP或抑制CRABP的表達(dá)。我們用不同量的dsRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，atRA處理后用MTT試驗(yàn)檢測

6、細(xì)胞的活力，以此確定了最佳轉(zhuǎn)染條件。這個(gè)試驗(yàn)不僅證明干擾BmCRABP的表達(dá)使細(xì)胞對RA引起的生長抑制更加敏感，同時(shí)也證明了轉(zhuǎn)染的有效性。隨后用pEGFP-Cl-CRABP和dsRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，MTT試驗(yàn)表明，當(dāng)Bm5細(xì)胞過量表達(dá)CRABP時(shí)，用atRA處理后，細(xì)胞對atRA誘導(dǎo)的生長抑制產(chǎn)生耐受性；當(dāng)CRABP的表達(dá)被干擾而降低時(shí)，細(xì)胞對atRA引起的生長抑制作用更加敏感。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，CRABP是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，用atRA