番茄SIMPK1的互作蛋白篩選及初步功能分析.pdf

1、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)被認(rèn)為是植物細(xì)胞將胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)換成胞內(nèi)反應(yīng)的主要途徑之一，在響應(yīng)各種環(huán)境脅迫的生理狀態(tài)與基因表達(dá)方面，起著重要的作用，其主要作用模式為MAPK三級(jí)聯(lián)模式(MAPKKK-MAPKK-MAPK)。隨著大規(guī)模篩選技術(shù)如酵母雙雜交技術(shù)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的MAPK相互作用蛋白可以被鑒定，尤其是MAPK下游的靶蛋白。因此，

2、鑒定植物MAPK的互作蛋白并探究其功能在植物生命科學(xué)研究中顯得尤為重要。
　　我們已有的研究表明，番茄SlMPK1在高溫脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其作用機(jī)理不清楚。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選高溫誘導(dǎo)的番茄cDNA文庫(kù)，獲得了多個(gè)SlMPK1可能互作的蛋白;在酵母細(xì)胞內(nèi)以及利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)對(duì)部分SlMPK1互作蛋白篩選結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證;并對(duì)成功驗(yàn)證相互作用的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位;另外，利用qRT-PCP對(duì)各個(gè)互作蛋白

3、編碼基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量，分析它們?cè)诜巡煌M織中以及高溫脅迫下的表達(dá)模式。主要研究結(jié)果如下:
　　1、酵母雙雜篩選番茄SlMPK1的互作蛋白
　　本研究成功構(gòu)建了pGBKT7/SlMPK1誘餌載體，轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold菌株并進(jìn)行酵母自激活作用以及毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證誘餌蛋白(SlMPK1)對(duì)酵母沒(méi)有毒性，但有自激活，共轉(zhuǎn)誘餌質(zhì)粒與 pGADT7/EV載體的酵母在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-Hi

4、s/-Ade/+AbA+X-α-gal+20 mM3-AT）上沒(méi)有自激活，可用此培養(yǎng)基進(jìn)行文庫(kù)篩選。將番茄cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7/SlMPK1的Y2HGold菌株，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選，從文庫(kù)中篩選出多個(gè)與SlMPK1相互作用的蛋白。
　　2、酵母細(xì)胞內(nèi)的SlMPK1互作蛋白篩選結(jié)果驗(yàn)證
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了多個(gè)陽(yáng)性蛋白編碼基因的CDS全長(zhǎng)序列，構(gòu)建了pGADT7/04330、pGADT7/MVQl、pG

5、ADT7/SK、pGADT7/SlMPKK、pGBKT7/04330、pGBKT7/SK、pGBKT7/MVQ1和pGBKT7/SlMPKK9載體，并分別與pGBKT7/ SlMPK1和pGADT7/SlMPK1共轉(zhuǎn)酵母Y2HGold菌株進(jìn)行互作驗(yàn)證。酵母細(xì)胞內(nèi)的相互作用驗(yàn)證結(jié)果表明，SlMPK1與04330、SKI、MVQ1和SlMPKK9蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。
　　3、利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)驗(yàn)證SlMPK1

6、互作蛋白的篩選結(jié)果
　　將誘餌蛋白(SlMPK1)與互作蛋白(04330、SKI、MVQ1、SlMPKK2和SlMPKK9)分別與黃色熒光蛋白(YFP)的C端片段和N端片段融合，構(gòu)建雙分子熒光載體pSPYCE/SlMPK1、pSPYNE/04330、pSPYNE/SKI、pSPYNE/MVQ1、 pSPYNE/SlMPKK2和pSPYNE/SlMPKK9，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SlMPK1與04

7、330、SKI和MVQ1在植物活體細(xì)胞中有相互作用，SlMPK1與SKI相互作用定位于細(xì)胞核中;04330蛋白與SlMPK1蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均有作用;MVQ1與SlMPK1蛋白相互作用可能定位于細(xì)胞質(zhì)及核膜中。
　　4、SlMPK1互作蛋白的亞細(xì)胞定位
　　將SlMPK1、04330、SKI、MVQ1和SlMPKK9與綠色熒光蛋白(GFP)融合，構(gòu)建熒光定位載體pEGAD/SlMPK1、pEGAD/04330、pEGA

8、D/SKI、pEGAD/MVQ1和pEGAD/SlMPKK9，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SlMPK1、04330和SlMPKK9主要定位于煙草細(xì)胞的細(xì)胞核中，在細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá);SKI定位于細(xì)胞核中;MVQ1可能定位于細(xì)胞質(zhì)及核膜中。
　　5、SlMPK1互作蛋白編碼基因的表達(dá)特征分析
　　利用qRT-PCR對(duì)SlMPK1、04330、SKI、MVQ1和SlMPKK9基因在在番茄不同組織中以及