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文檔簡介
1、家蠶的表皮覆蓋在其整個身體表面,參與了防止病原微生物的入侵、物理損傷、脫水等生理功能。表皮在家蠶發(fā)育過程中對其體形的塑造、維持正?;顒幽芰κ潜夭豢缮俚模瑯O大地增強(qiáng)了家蠶的生存和適應(yīng)外界環(huán)境的能力。家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白作為表皮中重要的結(jié)構(gòu)蛋白,參與了其蛻皮、變態(tài)發(fā)育等過程。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白廣泛地存在于昆蟲表皮、圍食膜當(dāng)中,它可以與幾丁質(zhì)相互結(jié)合形成復(fù)合物,參與昆蟲表皮和圍食膜結(jié)構(gòu)的形成。本研究主要通過生物信息分析、基因克隆、原核表達(dá)、West
2、ern Blot、免疫熒光、RNAi等方法對家蠶體內(nèi)的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(BmCBP)進(jìn)行鑒定,并對其在家蠶體內(nèi)的分布及表達(dá)調(diào)控方式進(jìn)行探究,為深入研究幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在家蠶變態(tài)發(fā)育中的作用提供支持。
本研究主要內(nèi)容包括:⑴對其中鑒定到兩個編碼幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的基因,分別命名為 BmCBP1和BmCBP2,其中BmCBP1編碼237個氨基酸,成熟體大小約為26.4 kDa,等電點約利用已報道的含有ChtBD2結(jié)構(gòu)域幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白氨基酸
3、序列檢索家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫,共鑒定到46個含有ChtBD2結(jié)構(gòu)域的編碼蛋白,并分類命名為四個家族,分別包括26個圍食膜因子相似蛋白(CPAPs),13個圍食膜蛋白(PMPs),4個幾丁質(zhì)酶(CHT)和3個幾丁質(zhì)去乙酰化酶(CDA)。對各家族ChtBD2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)均含有6個高度保守的半胱氨酸,且包含50到63個氨基酸殘基數(shù)不等,各家族的半胱氨酸的間隔數(shù)沒有明顯區(qū)別。對上述鑒定到的蛋白通過基因芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)
4、,該家族的組織表達(dá)模式可以分為2類,其中第Ⅰ類主要在頭部、表皮高量表達(dá);第Ⅱ類主要在中腸高量表達(dá)。⑵為4.9;BmCBP2編碼227個氨基酸,成熟大小約為25.7 kDa,等電點約為4.6,兩者均含有三個富含半胱氨酸的ChtBD2結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)BmCBP1和BmCBP2可能在家蠶中存在較早的分化。對BmCBP1和 BmCBP2基因進(jìn)行克隆、表達(dá),對其表達(dá)形式分析發(fā)現(xiàn)BmCBP1主要以包涵體形式表達(dá),BmCBP2的主要以可溶性形式表
5、達(dá),進(jìn)一步對可溶性表達(dá)的BmCBP2其進(jìn)行純化,得到的高純度蛋白并制備多克隆抗體。效價檢測顯示BmCBP2的抗體效價高于1:512,000,濃度為1.60 mg/ml,抗體特異性檢測顯示BmCBP2的多克隆抗體可與抗原特異性結(jié)合,制備的抗體可用于后續(xù)實驗。⑶核酸水平檢測家蠶5齡第3天各組織以及各時期BmCBP1和BmCBP2的表達(dá)情況。RT-PCR及Q-PCR結(jié)果顯示,BmCBP1、BmCBP2均主要在頭部、表皮中表達(dá)量較高。時期表達(dá)特
6、征結(jié)果顯示,BmCBP1、BmCBP2主要在上蔟時期以及蛹末期高量表達(dá)。進(jìn)一步在蛋白水平檢測BmCBP2家蠶預(yù)蛹期各組織及各時期表達(dá),預(yù)蛹期各組織表達(dá)譜顯示BmCBP2主要在頭部、表皮中有高量表達(dá),而時期表達(dá)特征結(jié)果顯示BmCBP2在眠期和變態(tài)發(fā)育期上調(diào)表達(dá),蛋白水平Western Blot檢測結(jié)果基本與核酸水平相一致。通過蛻皮激素注射家蠶,Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)BmCBP2受到蛻皮激素的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示,幾丁質(zhì)主要定位在家蠶
7、體壁的表皮層,BmCBP2則存在于家蠶體壁的表皮層和皮細(xì)胞層。進(jìn)一步通過免疫熒光對家蠶體壁4齡眠期不同時間點 BmCBP2蛋白和幾丁質(zhì)定位發(fā)現(xiàn),BmCBP2蛋白參與家蠶4齡眠期新表皮的形成過程。⑷將可溶性的重組BmCBP2與幾丁質(zhì)珠共同孵育,通過Western blot檢測,結(jié)果顯示BmCBP2蛋白能與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合,進(jìn)一步驗證該蛋白與幾丁質(zhì)互作,參與家蠶表皮的形成;構(gòu)建了帶有 GST標(biāo)簽的BmCBP2基因表達(dá)載體,利用GST-pul
8、l down對BmCBP2蛋白進(jìn)行了體外互作蛋白的研究,經(jīng)質(zhì)譜鑒定為CP8 precursor等蛋白,還需要進(jìn)一步實驗驗證。當(dāng)利用蛻皮液與BmCBP2蛋白共同孵育,發(fā)現(xiàn)蛻皮液中存在蛋白酶能夠特異性降解BmCBP2蛋白。通過RNAi干涉4齡眠期BmCBP2基因的表達(dá),在核酸水平檢測成功下調(diào)BmCBP2基因的表達(dá),然而在表型上并沒有明顯的變化,推測與BmCBP2基因在眠期持續(xù)性高表達(dá)有關(guān),以上結(jié)果為進(jìn)一步研究該蛋白的功能提供了重要研究線索。
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