家蠶表皮幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(BmCBP)鑒定及功能研究.pdf

1、家蠶的表皮覆蓋在其整個身體表面，參與了防止病原微生物的入侵、物理損傷、脫水等生理功能。表皮在家蠶發(fā)育過程中對其體形的塑造、維持正?；顒幽芰κ潜夭豢缮俚?，極大地增強了家蠶的生存和適應(yīng)外界環(huán)境的能力。家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白作為表皮中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與了其蛻皮、變態(tài)發(fā)育等過程。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白廣泛地存在于昆蟲表皮、圍食膜當(dāng)中，它可以與幾丁質(zhì)相互結(jié)合形成復(fù)合物，參與昆蟲表皮和圍食膜結(jié)構(gòu)的形成。本研究主要通過生物信息分析、基因克隆、原核表達、West

2、ern Blot、免疫熒光、RNAi等方法對家蠶體內(nèi)的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（BmCBP）進行鑒定，并對其在家蠶體內(nèi)的分布及表達調(diào)控方式進行探究，為深入研究幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在家蠶變態(tài)發(fā)育中的作用提供支持。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴對其中鑒定到兩個編碼幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的基因，分別命名為 BmCBP1和BmCBP2，其中BmCBP1編碼237個氨基酸，成熟體大小約為26.4 kDa，等電點約利用已報道的含有ChtBD2結(jié)構(gòu)域幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白氨基酸

3、序列檢索家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫，共鑒定到46個含有ChtBD2結(jié)構(gòu)域的編碼蛋白，并分類命名為四個家族，分別包括26個圍食膜因子相似蛋白（CPAPs），13個圍食膜蛋白（PMPs），4個幾丁質(zhì)酶（CHT）和3個幾丁質(zhì)去乙酰化酶（CDA）。對各家族ChtBD2結(jié)構(gòu)域進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)均含有6個高度保守的半胱氨酸，且包含50到63個氨基酸殘基數(shù)不等，各家族的半胱氨酸的間隔數(shù)沒有明顯區(qū)別。對上述鑒定到的蛋白通過基因芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)

4、，該家族的組織表達模式可以分為2類，其中第Ⅰ類主要在頭部、表皮高量表達；第Ⅱ類主要在中腸高量表達。⑵為4.9；BmCBP2編碼227個氨基酸，成熟大小約為25.7 kDa，等電點約為4.6，兩者均含有三個富含半胱氨酸的ChtBD2結(jié)構(gòu)域。進化分析發(fā)現(xiàn)BmCBP1和BmCBP2可能在家蠶中存在較早的分化。對BmCBP1和 BmCBP2基因進行克隆、表達，對其表達形式分析發(fā)現(xiàn)BmCBP1主要以包涵體形式表達，BmCBP2的主要以可溶性形式表

5、達，進一步對可溶性表達的BmCBP2其進行純化，得到的高純度蛋白并制備多克隆抗體。效價檢測顯示BmCBP2的抗體效價高于1：512,000，濃度為1.60 mg/ml，抗體特異性檢測顯示BmCBP2的多克隆抗體可與抗原特異性結(jié)合，制備的抗體可用于后續(xù)實驗。⑶核酸水平檢測家蠶5齡第3天各組織以及各時期BmCBP1和BmCBP2的表達情況。RT-PCR及Q-PCR結(jié)果顯示，BmCBP1、BmCBP2均主要在頭部、表皮中表達量較高。時期表達特

6、征結(jié)果顯示，BmCBP1、BmCBP2主要在上蔟時期以及蛹末期高量表達。進一步在蛋白水平檢測BmCBP2家蠶預(yù)蛹期各組織及各時期表達，預(yù)蛹期各組織表達譜顯示BmCBP2主要在頭部、表皮中有高量表達，而時期表達特征結(jié)果顯示BmCBP2在眠期和變態(tài)發(fā)育期上調(diào)表達，蛋白水平Western Blot檢測結(jié)果基本與核酸水平相一致。通過蛻皮激素注射家蠶，Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)BmCBP2受到蛻皮激素的誘導(dǎo)上調(diào)表達。免疫熒光結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)主要定位在家蠶

7、體壁的表皮層，BmCBP2則存在于家蠶體壁的表皮層和皮細胞層。進一步通過免疫熒光對家蠶體壁4齡眠期不同時間點 BmCBP2蛋白和幾丁質(zhì)定位發(fā)現(xiàn)，BmCBP2蛋白參與家蠶4齡眠期新表皮的形成過程。⑷將可溶性的重組BmCBP2與幾丁質(zhì)珠共同孵育，通過Western blot檢測，結(jié)果顯示BmCBP2蛋白能與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合，進一步驗證該蛋白與幾丁質(zhì)互作，參與家蠶表皮的形成；構(gòu)建了帶有 GST標(biāo)簽的BmCBP2基因表達載體，利用GST-pul

8、l down對BmCBP2蛋白進行了體外互作蛋白的研究，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為CP8 precursor等蛋白，還需要進一步實驗驗證。當(dāng)利用蛻皮液與BmCBP2蛋白共同孵育，發(fā)現(xiàn)蛻皮液中存在蛋白酶能夠特異性降解BmCBP2蛋白。通過RNAi干涉4齡眠期BmCBP2基因的表達，在核酸水平檢測成功下調(diào)BmCBP2基因的表達，然而在表型上并沒有明顯的變化，推測與BmCBP2基因在眠期持續(xù)性高表達有關(guān)，以上結(jié)果為進一步研究該蛋白的功能提供了重要研究線索。