家蠶表皮幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(BmCBP)鑒定及功能研究.pdf

1、家蠶的表皮覆蓋在其整個(gè)身體表面，參與了防止病原微生物的入侵、物理損傷、脫水等生理功能。表皮在家蠶發(fā)育過程中對(duì)其體形的塑造、維持正?；顒?dòng)能力是必不可少的，極大地增強(qiáng)了家蠶的生存和適應(yīng)外界環(huán)境的能力。家蠶幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白作為表皮中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與了其蛻皮、變態(tài)發(fā)育等過程。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白廣泛地存在于昆蟲表皮、圍食膜當(dāng)中，它可以與幾丁質(zhì)相互結(jié)合形成復(fù)合物，參與昆蟲表皮和圍食膜結(jié)構(gòu)的形成。本研究主要通過生物信息分析、基因克隆、原核表達(dá)、West

2、ern Blot、免疫熒光、RNAi等方法對(duì)家蠶體內(nèi)的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（BmCBP）進(jìn)行鑒定，并對(duì)其在家蠶體內(nèi)的分布及表達(dá)調(diào)控方式進(jìn)行探究，為深入研究幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在家蠶變態(tài)發(fā)育中的作用提供支持。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴對(duì)其中鑒定到兩個(gè)編碼幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的基因，分別命名為 BmCBP1和BmCBP2，其中BmCBP1編碼237個(gè)氨基酸，成熟體大小約為26.4 kDa，等電點(diǎn)約利用已報(bào)道的含有ChtBD2結(jié)構(gòu)域幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白氨基酸

3、序列檢索家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫，共鑒定到46個(gè)含有ChtBD2結(jié)構(gòu)域的編碼蛋白，并分類命名為四個(gè)家族，分別包括26個(gè)圍食膜因子相似蛋白（CPAPs），13個(gè)圍食膜蛋白（PMPs），4個(gè)幾丁質(zhì)酶（CHT）和3個(gè)幾丁質(zhì)去乙酰化酶（CDA）。對(duì)各家族ChtBD2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)均含有6個(gè)高度保守的半胱氨酸，且包含50到63個(gè)氨基酸殘基數(shù)不等，各家族的半胱氨酸的間隔數(shù)沒有明顯區(qū)別。對(duì)上述鑒定到的蛋白通過基因芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)

4、，該家族的組織表達(dá)模式可以分為2類，其中第Ⅰ類主要在頭部、表皮高量表達(dá)；第Ⅱ類主要在中腸高量表達(dá)。⑵為4.9；BmCBP2編碼227個(gè)氨基酸，成熟大小約為25.7 kDa，等電點(diǎn)約為4.6，兩者均含有三個(gè)富含半胱氨酸的ChtBD2結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)BmCBP1和BmCBP2可能在家蠶中存在較早的分化。對(duì)BmCBP1和 BmCBP2基因進(jìn)行克隆、表達(dá)，對(duì)其表達(dá)形式分析發(fā)現(xiàn)BmCBP1主要以包涵體形式表達(dá)，BmCBP2的主要以可溶性形式表

5、達(dá)，進(jìn)一步對(duì)可溶性表達(dá)的BmCBP2其進(jìn)行純化，得到的高純度蛋白并制備多克隆抗體。效價(jià)檢測(cè)顯示BmCBP2的抗體效價(jià)高于1：512,000，濃度為1.60 mg/ml，抗體特異性檢測(cè)顯示BmCBP2的多克隆抗體可與抗原特異性結(jié)合，制備的抗體可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑶核酸水平檢測(cè)家蠶5齡第3天各組織以及各時(shí)期BmCBP1和BmCBP2的表達(dá)情況。RT-PCR及Q-PCR結(jié)果顯示，BmCBP1、BmCBP2均主要在頭部、表皮中表達(dá)量較高。時(shí)期表達(dá)特

6、征結(jié)果顯示，BmCBP1、BmCBP2主要在上蔟時(shí)期以及蛹末期高量表達(dá)。進(jìn)一步在蛋白水平檢測(cè)BmCBP2家蠶預(yù)蛹期各組織及各時(shí)期表達(dá)，預(yù)蛹期各組織表達(dá)譜顯示BmCBP2主要在頭部、表皮中有高量表達(dá)，而時(shí)期表達(dá)特征結(jié)果顯示BmCBP2在眠期和變態(tài)發(fā)育期上調(diào)表達(dá)，蛋白水平Western Blot檢測(cè)結(jié)果基本與核酸水平相一致。通過蛻皮激素注射家蠶，Q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BmCBP2受到蛻皮激素的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)主要定位在家蠶

7、體壁的表皮層，BmCBP2則存在于家蠶體壁的表皮層和皮細(xì)胞層。進(jìn)一步通過免疫熒光對(duì)家蠶體壁4齡眠期不同時(shí)間點(diǎn) BmCBP2蛋白和幾丁質(zhì)定位發(fā)現(xiàn)，BmCBP2蛋白參與家蠶4齡眠期新表皮的形成過程。⑷將可溶性的重組BmCBP2與幾丁質(zhì)珠共同孵育，通過Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示BmCBP2蛋白能與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合，進(jìn)一步驗(yàn)證該蛋白與幾丁質(zhì)互作，參與家蠶表皮的形成；構(gòu)建了帶有 GST標(biāo)簽的BmCBP2基因表達(dá)載體，利用GST-pul

8、l down對(duì)BmCBP2蛋白進(jìn)行了體外互作蛋白的研究，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為CP8 precursor等蛋白，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。當(dāng)利用蛻皮液與BmCBP2蛋白共同孵育，發(fā)現(xiàn)蛻皮液中存在蛋白酶能夠特異性降解BmCBP2蛋白。通過RNAi干涉4齡眠期BmCBP2基因的表達(dá)，在核酸水平檢測(cè)成功下調(diào)BmCBP2基因的表達(dá)，然而在表型上并沒有明顯的變化，推測(cè)與BmCBP2基因在眠期持續(xù)性高表達(dá)有關(guān)，以上結(jié)果為進(jìn)一步研究該蛋白的功能提供了重要研究線索。