斜帶石斑魚IL-10和IL-16的原核表達及其在魚體內(nèi)組織特異性表達研究.pdf

1、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和白細(xì)胞介素-16(IL-16)是重要的多效細(xì)胞因子，在特異性和非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用。本研究以我國重要的海水養(yǎng)殖魚類斜帶石斑魚為對象，利用同源克隆以及RACE技術(shù)獲得了斜帶石斑魚IL-10基因cDNA全長，為1104bp，其ORF為564bp，編碼187個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為21.7kDa，等電點為5.74，含有信號肽，無跨膜區(qū)?；贗L-10蛋白氨基酸同源性及進化分析顯示，斜帶石斑魚與吉富羅非

2、魚（Oreochromis niloticus）親緣關(guān)系較近，表明所獲得的序列是斜帶石斑魚IL-10基因。根據(jù)GenBank已登錄的基因片段，利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得了斜帶石斑魚IL-16基因cDNA序列，全長為2859bp，其ORF為1896bp，編碼631個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為68.2kDa，理論等電點為5.36，無信號肽，無跨膜區(qū)。基于IL-16氨基酸序列的進化分析表明斜帶石斑魚與大黃魚(Larimichthyscroc

3、ea)親緣關(guān)系較近，說明所獲得的序列是斜帶石斑魚IL-16基因。
　　利用雙酶切和質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建了重組基因原核表達載體pET32-IL-10和pET32-IL-16質(zhì)粒，成功表達了重組蛋白IL-10和IL-16。經(jīng)優(yōu)化表達條件，IPTG濃度為0.02mmol/L、37℃誘導(dǎo)3h為IL-10重組蛋白表達最佳條件;IPTG濃度為0.2mmol/L、37℃誘導(dǎo)7h為IL-16重組蛋白表達最佳條件。
　　運用Real-Time P

4、CR技術(shù)，分析斜帶石斑魚IL-10和IL-16基因在健康石斑魚各組織的表達，同時，分析在滅活哈維氏弧菌刺激后，斜帶石斑魚IL-10和IL-16基因在鰓、胸腺、頭腎、體腎、腸、肝、脾和腦的表達差異以及其隨時間變化的差異表達。結(jié)果顯示，在健康斜帶石斑魚體內(nèi)，IL-10主要在鰓中表達，其他組織中的表達量比較低。經(jīng)滅活哈維氏弧菌刺激3h后，IL-10在頭腎、體腎、腸、肝、脾和腦中的表達均發(fā)生上調(diào)。IL-10在免疫后隨時間差異表達研究表明，在刺激