干旱和鹽脅迫中桑microRNA差異表達(dá)分析.pdf

1、MicroRNAs（miRNAs）是一類長度為18～24nt的非編碼內(nèi)源性小 RNA，廣泛存在于真核生物細(xì)胞、細(xì)菌、病毒中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其主要通過剪切靶基因和抑制翻譯調(diào)控生物的基因表達(dá)，由此影響生物的生長過程以及生物的抗生物脅迫和非生物脅迫的能力。
　　桑樹是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，但各種逆境條件和病蟲害往往會(huì)對桑樹的產(chǎn)量造成重大影響。研究桑樹在脅迫條件下的miRNA的表達(dá)情況，對桑樹種質(zhì)資源的保存和提高桑樹產(chǎn)量有重要作用。與其他作物

2、相比，對桑樹miRNA的研究至今還處于初始階段，對桑樹的miRNA及其功能仍然了解很少。因此，開展桑樹miRNA的研究對于桑樹資源的開發(fā)是一項(xiàng)非常有意義的工作。本研究以干旱和鹽處理后的桑樹為實(shí)驗(yàn)材料，研究在干旱和鹽脅迫下相關(guān)miRNA的表達(dá)情況。本研究獲得以下結(jié)果：
　?。?）對桑苗分別進(jìn)行干旱和0.3 mol/L的鹽溶液脅迫處理。分別取干旱組、鹽脅迫組，對照組不同時(shí)間的幼葉組織RNA，建立小RNA文庫，采用small RNA s

3、olexa高通量測序技術(shù)分別對構(gòu)建好的三個(gè)小RNA文庫進(jìn)行microRNA的表達(dá)譜分析。測序結(jié)果：干旱組、鹽組及對照組分別得到高質(zhì)量序列13878088條、13619220條和15711033條，與桑樹基因組的完美匹配度達(dá)50％以上。共分析得到保守miRNA69條，預(yù)測得到新的miRNA205條。其中，約45%的miRNA長度為24nt。
　?。?）對測序數(shù)據(jù)分析得到的miRNA進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫與對照組比對中，有2

4、0個(gè)miRNA差異表達(dá)顯著。其中干旱組中有13個(gè)miRNA差異表達(dá)顯著，上調(diào)差異表達(dá)4個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)9個(gè)；鹽脅迫組中有12個(gè)miRNA差異表達(dá)顯著，上調(diào)差異表達(dá)4個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)8個(gè)。然后應(yīng)用 Stem-loop RT-PCR方法對這20種miRNA的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果干旱組中，共13個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中4個(gè)上調(diào)表達(dá)，9個(gè)下調(diào)表達(dá)。這種趨勢和在測序分析的結(jié)果一致。在鹽脅迫組中，共有12個(gè)差異表達(dá)，其中7個(gè)上調(diào)表達(dá)，5個(gè)下調(diào)表

5、達(dá)。
　?。?）利用生物信息學(xué)軟件 psRNAtarget以及川?；蚪M，對所有測序得到的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，結(jié)果預(yù)測到175個(gè)miRNA的577條靶基因。為了驗(yàn)證miRNA對靶基因的調(diào)控方式，找出一個(gè)miR395a，該miRNA在干旱脅迫時(shí)表達(dá)下調(diào)，并獲取該miRNA的靶基因ATP硫酸化酶1基因。本研究使用real time RT-PCR技術(shù)對該靶基因進(jìn)行熒光定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫處理不同時(shí)期，該基因表達(dá)量上升。證明