腎移植排斥反應中microRNA差異表達研究.pdf

1、腎移植是目前終末期腎病患者最理想、最經(jīng)濟的一種治療方法，但移植后排斥反應嚴重影響著移植物及受者的存活。目前，移植腎活檢是能明確診斷排斥反應的唯一方法，但此法即昂貴又不方便還易引起腎損傷導致各種并發(fā)癥。因此新的有效、方便、無創(chuàng)傷的排斥反應早期生物標記，將能大大提高腎移植治療效率。在此方面研究人員做了大量工作，主要方向為使用先進的科學技術從患者尿液和外周血中尋找排斥反應的早期生物標記，但目前這些研究成果均還未能運用于臨床。 微小RN

2、A（microRNA，miRNA）是一類長約21～24nt的通過轉錄后負調(diào)控靶基因表達的非蛋白編碼RNA分子。研究表明miRNA在胚胎發(fā)育，細胞分化及人類疾病的發(fā)生機制中起重要作用。 新的生物標記能及時、可靠、特異地預示移植物的趨勢，有助于進一步闡述排斥反應的發(fā)生機制。本研究的目的在于應用miRNA芯片技術，篩選在腎移植急性、慢性排斥反應中差異表達顯著的miRNA，并通過預測差異表達miRNA靶分子，進一步探討miRNA在腎移植

3、排斥反應中的作用機制。 研究材料與方法： 1. 取3例自腎腫瘤切除術中遠離腫瘤組織且病理檢查正常的腎皮質(zhì)做為實驗對照組；3例腎移植急性排斥反應患者腎穿標本做為腎移植急性排斥組；4例腎移植慢性排斥反應患者腎穿標本做為腎移植急性排斥組。 2. Trizol法分離總RNA，使用紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。 3． 標記所提取總RNA中的miRNA，濃縮標記樣品，采用miRCURYTM Arr

4、ay microarray kit試劑盒進行miRNA芯片雜交。 4．使用Genepix 4000B 進行圖像掃描，使用635nm激發(fā)，圖像存成TIF文件；采用Genepix Pro 6.0分析數(shù)據(jù)，分析結果導出，最終用EXCEL文件表示。 5．實時定量PCR技術驗證芯片結果 6．TargetScan軟件預測差異表達miRNA靶基因，尋找與腎移植排斥反應發(fā)生相關的分子。 實驗結果: 1．所提取的R

5、NA經(jīng)過檢測符合芯片實驗需求。 2．急性排斥組和對照組芯片研究結果發(fā)現(xiàn)21個miRNA差異表達顯著，其中13個表達顯著下調(diào)，8個表達顯著上調(diào)。14個差異表達顯著的miRNA可查詢到序列和基因位點等信息。 3．利用芯片比較分析慢性排斥組與對照組miRNA表達，發(fā)現(xiàn)63個miRNA差異表達顯著。其中35個表達顯著上調(diào)，28個miRNA表達顯著下調(diào)。45個差異表達顯著的miRNA可查詢到序列和基因位點等信息。 4．選急

6、性排斥反應組中差異表達顯著的has-miR-320,has-miR-324-3p和慢性排斥反應組中差異表達顯著的has-miR-637,has-miR-648，has-miR-516-5p進行相對定量研究，其結果均符合芯片分析結果。 5．應用TargetScan軟件可預測到急性排斥組中13個差異表達顯著的miRNA靶基因，總數(shù)為2617個；慢性排斥組中32個差異表達顯著的miRNA靶基因，總數(shù)為7177個,其中6個與急性排斥組相

7、同。急排和慢排組共可預測38個差異表達顯著miRNA靶基因，其中18個miRNA靶基因與人類疾病有直接關系例如腫瘤和血液疾病等，20個miRNA在人類生理機理中起廣泛調(diào)控作用。 實驗結論： 1．微陣列芯片是有效的高通量分析腎移植排斥反應miRNA差異表達的研究手段。 2．使用芯片篩選出20個在腎移植急性排斥反應中差異表達顯著的miRNA；63個在腎移植慢性排斥反應中差異表達顯著的miRNA，證實miRNA在腎移植

8、排斥反應中出現(xiàn)顯著的差異表達。 3．用實時定量PCR對所挑選的5個miRNA進行定量表達研究，其結果與芯片結果一致，證實了芯片結果的可靠性。實時熒光定量PCR是檢測單個miRNA表達水平的有效手段。 4．預測的差異表達顯著miRNA靶分子中包括多個腫瘤基因,血液疾病基因，并且廣泛參與基因的轉錄調(diào)控過程，miRNA有可能是腎移植排斥反應的新的有效生物標記。 差異表達miRNA的研究有助于進一步了解腎移植排斥反應發(fā)生