腎移植排斥反應(yīng)中microRNA差異表達(dá)研究.pdf

1、腎移植是目前終末期腎病患者最理想、最經(jīng)濟的一種治療方法，但移植后排斥反應(yīng)嚴(yán)重影響著移植物及受者的存活。目前，移植腎活檢是能明確診斷排斥反應(yīng)的唯一方法，但此法即昂貴又不方便還易引起腎損傷導(dǎo)致各種并發(fā)癥。因此新的有效、方便、無創(chuàng)傷的排斥反應(yīng)早期生物標(biāo)記，將能大大提高腎移植治療效率。在此方面研究人員做了大量工作，主要方向為使用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)從患者尿液和外周血中尋找排斥反應(yīng)的早期生物標(biāo)記，但目前這些研究成果均還未能運用于臨床。 微小RN

2、A（microRNA，miRNA）是一類長約21～24nt的通過轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)的非蛋白編碼RNA分子。研究表明miRNA在胚胎發(fā)育，細(xì)胞分化及人類疾病的發(fā)生機制中起重要作用。 新的生物標(biāo)記能及時、可靠、特異地預(yù)示移植物的趨勢，有助于進(jìn)一步闡述排斥反應(yīng)的發(fā)生機制。本研究的目的在于應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)，篩選在腎移植急性、慢性排斥反應(yīng)中差異表達(dá)顯著的miRNA，并通過預(yù)測差異表達(dá)miRNA靶分子，進(jìn)一步探討miRNA在腎移植

3、排斥反應(yīng)中的作用機制。 研究材料與方法： 1. 取3例自腎腫瘤切除術(shù)中遠(yuǎn)離腫瘤組織且病理檢查正常的腎皮質(zhì)做為實驗對照組；3例腎移植急性排斥反應(yīng)患者腎穿標(biāo)本做為腎移植急性排斥組；4例腎移植慢性排斥反應(yīng)患者腎穿標(biāo)本做為腎移植急性排斥組。 2. Trizol法分離總RNA，使用紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。 3． 標(biāo)記所提取總RNA中的miRNA，濃縮標(biāo)記樣品，采用miRCURYTM Arr

4、ay microarray kit試劑盒進(jìn)行miRNA芯片雜交。 4．使用Genepix 4000B 進(jìn)行圖像掃描，使用635nm激發(fā)，圖像存成TIF文件；采用Genepix Pro 6.0分析數(shù)據(jù)，分析結(jié)果導(dǎo)出，最終用EXCEL文件表示。 5．實時定量PCR技術(shù)驗證芯片結(jié)果 6．TargetScan軟件預(yù)測差異表達(dá)miRNA靶基因，尋找與腎移植排斥反應(yīng)發(fā)生相關(guān)的分子。 實驗結(jié)果: 1．所提取的R

5、NA經(jīng)過檢測符合芯片實驗需求。 2．急性排斥組和對照組芯片研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)21個miRNA差異表達(dá)顯著，其中13個表達(dá)顯著下調(diào)，8個表達(dá)顯著上調(diào)。14個差異表達(dá)顯著的miRNA可查詢到序列和基因位點等信息。 3．利用芯片比較分析慢性排斥組與對照組miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)63個miRNA差異表達(dá)顯著。其中35個表達(dá)顯著上調(diào)，28個miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。45個差異表達(dá)顯著的miRNA可查詢到序列和基因位點等信息。 4．選急

6、性排斥反應(yīng)組中差異表達(dá)顯著的has-miR-320,has-miR-324-3p和慢性排斥反應(yīng)組中差異表達(dá)顯著的has-miR-637,has-miR-648，has-miR-516-5p進(jìn)行相對定量研究，其結(jié)果均符合芯片分析結(jié)果。 5．應(yīng)用TargetScan軟件可預(yù)測到急性排斥組中13個差異表達(dá)顯著的miRNA靶基因，總數(shù)為2617個；慢性排斥組中32個差異表達(dá)顯著的miRNA靶基因，總數(shù)為7177個,其中6個與急性排斥組相

7、同。急排和慢排組共可預(yù)測38個差異表達(dá)顯著miRNA靶基因，其中18個miRNA靶基因與人類疾病有直接關(guān)系例如腫瘤和血液疾病等，20個miRNA在人類生理機理中起廣泛調(diào)控作用。 實驗結(jié)論： 1．微陣列芯片是有效的高通量分析腎移植排斥反應(yīng)miRNA差異表達(dá)的研究手段。 2．使用芯片篩選出20個在腎移植急性排斥反應(yīng)中差異表達(dá)顯著的miRNA；63個在腎移植慢性排斥反應(yīng)中差異表達(dá)顯著的miRNA，證實miRNA在腎移植

8、排斥反應(yīng)中出現(xiàn)顯著的差異表達(dá)。 3．用實時定量PCR對所挑選的5個miRNA進(jìn)行定量表達(dá)研究，其結(jié)果與芯片結(jié)果一致，證實了芯片結(jié)果的可靠性。實時熒光定量PCR是檢測單個miRNA表達(dá)水平的有效手段。 4．預(yù)測的差異表達(dá)顯著miRNA靶分子中包括多個腫瘤基因,血液疾病基因，并且廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，miRNA有可能是腎移植排斥反應(yīng)的新的有效生物標(biāo)記。 差異表達(dá)miRNA的研究有助于進(jìn)一步了解腎移植排斥反應(yīng)發(fā)生