中華蜜蜂硫氧還蛋白過氧化物酶、硫氧還蛋白和谷氧還蛋白相關(guān)基因功能分析.pdf

1、硫氧還蛋白過氧化物酶(Tpxs)、硫氧還蛋白(Trxs)和谷氧還蛋白(Grxs)作為生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在維持氧化還原平衡和保護(hù)機(jī)體免受ROS損傷方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前關(guān)于Tpxs、 Trxs和Grxs基因的研究主要在哺乳動(dòng)物、果蠅等模式物種，中華蜜蜂(Apis cerana cerana)中關(guān)于此類基因的研究很少。中華蜜蜂是我國特有的種質(zhì)資源，它耐寒抗病，在維持自然體系生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用。然而由于環(huán)境污染、濫用殺蟲劑

2、和感染性疾病等使中華蜜蜂的生存環(huán)境變得越來越惡劣，因此保護(hù)中華蜜蜂這一重要的種質(zhì)資源變得越來越緊迫。為了深入了解中華蜜蜂抗逆性作用機(jī)制，本研究從中華蜜蜂中克隆得到與抗氧化密切相關(guān)的五個(gè)新基因，并對(duì)它們進(jìn)行了氨基酸序列比對(duì)、表達(dá)特性和功能分析，具體結(jié)果如下:
　　(1)從中華蜜蜂中分離得到Tpx-3、Trx2、Grx1、Grx2和Trx1基因，并分別命名為AccTpx-3、AccTrx2、AccGrx1、AccGrx2和AccTrx

3、1，氨基酸序列比對(duì)、進(jìn)化樹和基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)以上中華蜜蜂抗氧化基因與意大利蜜蜂同類抗氧化基因的同源性較高，并且擁有高度保守的酶催化活性位點(diǎn)。
　　(2)利用qRT-PCR方法對(duì)中華蜜蜂以上五個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明，AccTpx-3在4日齡幼蟲表達(dá)量最高，其次在15日齡成蟲表達(dá)量較高;AccTrx2在15日齡成蟲中表達(dá)量最高，其次在4日齡幼蟲和黑眼蛹中表達(dá)量較高;AccGrx1、AccGrx2在黑眼

4、蛹中表達(dá)量最高;AccTrx1在15日齡成蟲表達(dá)量最高。
　　(3)利用qRT-PCR方法對(duì)中華蜜蜂以上五個(gè)基因在15日齡成蟲不同組織部位的表達(dá)特性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明AccTpx-3、AccTrx2、AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1分別在肌肉、腦部、脂肪體、肌肉和表皮中表達(dá)量最高。
　　(4)另外，采用qRT-PCR方法對(duì)以上五個(gè)基因在多種非生物氧化應(yīng)激中的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明以上五個(gè)基因受溫

5、度、過氧化氫、農(nóng)藥等非生物應(yīng)激處理誘導(dǎo)表達(dá)，說明以上五個(gè)基因參與抗氧化作用從而保護(hù)中華蜜蜂免受由ROS造成的氧化損傷。
　　(5)將在大腸桿菌中表達(dá)的AccTpx-3和AccTrx2進(jìn)行純化并經(jīng)SDS-PAGE檢測純化效果后，利用MFO系統(tǒng)檢測分析純化蛋白功能，發(fā)現(xiàn)純化的AccTpx-3和AccTrx2具有保護(hù)DNA免受ROS損傷的功能;另外在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)AccTpx-3可以減輕因百草枯導(dǎo)致的氧化損傷;純化AccTr

6、x2具有還原胰島素的能力，說明其為典型的硫氧還蛋白。
　　(6)利用體外合成的dsRNA將AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1分別成功沉默后發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂體內(nèi)的CAT、POD酶活性，過氧化氫、蛋白質(zhì)羰基、維生素C含量，GSH/GSSG、NADP+/NADPH的比率均升高，說明有其他抗氧化相關(guān)基因參與彌補(bǔ)被沉默基因的功能缺失。
　　(7)將AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx