綠僵菌雙功能過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化物酶基因MaKatG1的克隆與功能分析.pdf

1、綠僵菌(Metarhizium acridum)是一類重要的昆蟲病原真菌，在生物防治中起到重要的作用。它具有通過(guò)宿主體壁侵染害蟲這種獨(dú)特的侵染方式，因此在防治刺吸式口器害蟲中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。綠僵菌孢子粘附到昆蟲體壁后，在適宜的條件下會(huì)形成附著胞這種侵染器官，然后穿透體壁，進(jìn)入血淋巴，最終致死昆蟲。真菌體表侵染階段決定著是否能侵染以及侵染快慢，因此對(duì)這一時(shí)期綠僵菌的致病機(jī)制進(jìn)行研究，可以為提高真菌殺蟲劑的效率提供依據(jù)。我們課題組構(gòu)建了

2、綠僵菌在附著胞形成階段均一化cDNA文庫(kù)，在已知基因組序列的基礎(chǔ)上，我們克隆得到了綠僵菌雙功能過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化物酶基因MaKatG1，并采用基因敲除技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行分析。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.MaKatG1的克隆與序列分析
　　 我們根據(jù)已知的綠僵菌基因組序列，克隆得到了雙功能過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化物酶基因并將其命名為MaKatG1，Genbank登錄號(hào)為JN935023。該基因不含內(nèi)含子，其開放閱讀框

3、為2205bp，編碼一個(gè)含有734個(gè)氨基酸的蛋白。使用在線工具預(yù)測(cè)該基因的分子量為81kDa，理論等電點(diǎn)為5.88，而且不含信號(hào)肽。BLAST分析和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，綠僵菌的雙功能過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化物酶基因與其他真菌的過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化物酶基因具有較高的同源性。
　　 2.采用基因敲除的方法對(duì)MaKatG1的功能進(jìn)行分析
　　 為了研究該基因的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了MaKatG1的敲除載體pK2-pB-KatG1，通過(guò)農(nóng)桿菌介

4、導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將該載體轉(zhuǎn)入到綠僵菌CQMa102菌株，對(duì)篩選得到轉(zhuǎn)化子采用PCR分析和Southern blotting的方法進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到2個(gè)轉(zhuǎn)化子菌株。
　　 3.MaKatG1，與綠僵菌的抗氧化能力有關(guān)
　　 分別將野生型菌株和敲除菌株接種到含有過(guò)氧化氫和甲萘醌的PDA平板，觀察菌株在氧化條件下的生長(zhǎng)表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失MaKatG1這個(gè)基因后，菌株的生長(zhǎng)受到明顯抑制，并且隨著氧化劑濃度的升高，這種抑制更明顯。過(guò)

5、氧化氫的毒性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，野生型菌株的半致死劑量為6.3mM，而敲除菌株僅為1.8mM。
　　 4.MaKatG1編碼的蛋白具有過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶活性
　　 我們檢測(cè)了敲除菌株以及野生型菌株的過(guò)氧化氫酶酶活和過(guò)氧化物酶酶活，發(fā)現(xiàn)敲除菌株的過(guò)氧化氫酶酶活和過(guò)氧化物酶酶活明顯低于野生型菌株，在氧化條件下，這種差異更加明顯。
　　 5.MaKatG1影響綠僵菌的毒力
　　 我們對(duì)野生型菌株和敲除菌株進(jìn)行了生物學(xué)

6、毒力測(cè)定，采用注射的方式侵染蝗蟲，野生型菌株和敲除菌株的半致死時(shí)間沒(méi)有明顯差異，但是采用點(diǎn)滴侵染的方式侵染蝗蟲，敲除菌株的半致死時(shí)間顯著長(zhǎng)于野生型菌株。結(jié)果說(shuō)明該基因很有可能在侵染前期起作用。
　　 6.MaKatG1影響綠僵菌穿透體壁的能力
　　 用敲除菌株和野生型菌株分別采用點(diǎn)滴和注射的方式，對(duì)蝗蟲進(jìn)行侵染后，定時(shí)取血淋巴觀察蟲菌體的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果用注射的侵染方式，兩種菌株侵染后蝗蟲血淋巴的蟲菌體數(shù)量基本沒(méi)差異

7、，但是用點(diǎn)滴侵染時(shí)，敲除菌株侵染的蝗蟲血淋巴的蟲菌體數(shù)量明顯低于用野生型菌株侵染的蝗蟲血淋巴的蟲菌體數(shù)量。
　　 7.MaKatG1影響綠僵菌在活體蝗蟲體表的萌發(fā)和附著胞形成
　　 我們將敲除菌株和野生型菌株的新鮮孢子分別接種到活體蝗蟲翅膀和疏水性塑料表面，觀察孢子的萌發(fā)率和附著胞形成率。在蝗蟲翅膀，接種后18小時(shí)，敲除菌株的萌發(fā)率顯著低于野生型菌株；接種后24小時(shí)，敲除菌株的附著胞形成率顯著低于野生型菌株。但是在疏水性