杧果畸形病病原遺傳多樣性及其與杧果互作機(jī)制研究.pdf

1、由鐮刀菌引起的杧果畸形病是杧果生產(chǎn)上的重要病害之一,迄今為止未發(fā)現(xiàn)抗病品種及根治杧果畸形病的有效方法。因而進(jìn)行病原菌種群分析及其與寄主互作機(jī)制的研究,挖掘寄主耐抗病的有效基因,無疑會(huì)為抗病育種工作奠定理論基礎(chǔ)。本研究通過營(yíng)養(yǎng)親和群和ISSR技術(shù)分析了我國(guó)杧果畸形病病原菌的遺傳多樣性,通過生理生化測(cè)定、轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息分析探索了杧果與Fusarium mangiferae的互作機(jī)制,主要取得以下結(jié)果。
　　1、從我國(guó)杧果畸形病發(fā)病地采集

2、病組織進(jìn)行分離,柯赫氏法則驗(yàn)證后共獲得38個(gè)致病菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)和EF-α延伸因子序列分析鑒定為F.mangiferae。運(yùn)用VCG和ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)獲得的38個(gè)畸形病病原菌進(jìn)行遺傳多樣性分析。VCG研究結(jié)果表明,通過在含KClO3培養(yǎng)基(KPS)上誘導(dǎo)篩選,共獲得抗氯酸鹽、不能利用硝酸鹽營(yíng)養(yǎng)突變體(nit)455株,通過MM、NM和HM3種不同氮源培養(yǎng)基劃分出nit A、nit B、nit C、nit D四種突變類型,其中nit A出現(xiàn)

3、頻率最高,占總體的78.02％;nit B和nit C其次,分別占7.91%和13.63%;nit D最少,僅占0.44%。采用nit突變體互補(bǔ)型配對(duì)技術(shù),將獲得的突變菌株進(jìn)行配對(duì)培養(yǎng),測(cè)得不同的營(yíng)養(yǎng)體親合群(VCGs)數(shù)為5個(gè),其中VCG1內(nèi)包含30個(gè)菌株,3個(gè)菌株分布在VCG2內(nèi),VCG3和VCG4內(nèi)各含有2個(gè)菌株,菌株MG33單獨(dú)形成VCG5。ISSR分子標(biāo)記結(jié)果顯示,供試的38個(gè)菌株經(jīng)14條特異性引物共擴(kuò)增出72條帶,產(chǎn)物條帶介

4、于300-2000 bp,其中52條帶具有多態(tài)性,多態(tài)性比率為72.22%。38個(gè)菌株的相似系數(shù)值為0.5972-0.9862,其中菌株MG16和MG17之間的相似系數(shù)最大,為0.9862,菌株MG07和MG33的遺傳相似系數(shù)最小,為0.5972。利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析,在相似系數(shù)為0.76水平上分為5類,33個(gè)菌株分布在第Ⅴ類中,MG25和MG35聚合在一起(Ⅳ),菌株MG36(Ⅲ)、MG07(Ⅱ)和MG33(Ⅰ)分別形成單一分

5、支。
　　2、杧果畸形病病原菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明:供試的38個(gè)菌株對(duì)杧果的致病力存在一定的差異。病原菌在燕麥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快,在液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量最大,最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基;菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的最佳溫度均為25℃-28℃;光照和pH4-10的酸堿度對(duì)F.mangiferae菌絲生長(zhǎng)速度、孢子產(chǎn)生及萌發(fā)的影響不明顯。F.mangiferae生長(zhǎng)的最好碳氮源分別為蔗糖和酵母提取物。菌絲和分子孢子的

6、致死溫度分別是53℃和57℃。毒力測(cè)定結(jié)果表明:25%咪鮮胺乳油對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好,EC50和EC95分別為1.2004μg·mL-1和2.6239μg·mL-1;25%嘧菌酯懸浮劑能夠強(qiáng)烈抑制病原菌分生孢子的萌發(fā),EC50和EC95分別為0.5312μg·mL-1和2.9741μg·mL-1。
　　3、杧果與F.mangiferae互作生理機(jī)制研究結(jié)果表明,①接種病菌后,杧果頂芽?jī)?nèi)光合色素含量、可溶性總糖、還原性糖、

7、蔗糖和葡萄糖含量均先上升后下降;淀粉和纖維素含量隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降。在接種病菌初期,中性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶(合成方向)的活性上升。接種病菌后期,中性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合成酶(合成方向)和蔗糖磷酸合成酶活性下降,而蔗糖合成酶(分解方向)活性不斷上升。②病菌的侵染能夠引起杧果體內(nèi)礦質(zhì)元素含量發(fā)生改變,其中N、K、Fe和Mn的含量隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升,且上升幅度較大,其次是P、Mg、B和Zn,Cu和S的含量變化不明顯,Ca隨著接種時(shí)

8、間的延長(zhǎng)其含量不斷降低。③可溶性蛋白和RNA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),接種病菌45d時(shí)達(dá)到最大。DNA含量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。④F.mangiferae侵染促進(jìn)杧果頂芽產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量的增加;在F.mangiferae侵染杧果后,谷胱甘肽含量急劇下降,POD、CAT、SOD和GR的活性迅速上升,且在整個(gè)測(cè)試過程中始終維持在較高水平,而APX活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。⑤接種病菌后,杧果頂芽?jī)?nèi)赤霉素和生長(zhǎng)素含量急速上

9、升,且在整個(gè)試驗(yàn)階段明顯高于對(duì)照處理,脫落酸含量在試驗(yàn)后期不斷升高。⑥病菌侵染對(duì)杧果頂芽的酚類代謝也產(chǎn)生了一定的影響,接種病菌45d內(nèi),杧果頂芽總酚、類黃酮含量及PAL酶活性均明顯提高,隨后急速下降,PPO活性初期變化不大,后期不斷上升。
　　4、基于Illumina HiSeq 2000平臺(tái),對(duì)健康與感病杧果頂芽的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序,采用BLAST軟件將獲得的Unigene與nr、Swiss-Prot、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比

10、對(duì),基因功能注釋后分析杧果病健組織的差異表達(dá)基因(DEGs),并對(duì)DEGs進(jìn)行GO和Pathway富集分析。結(jié)果表明,①2個(gè)樣品共獲得119,815條Unigene,N50為1546,平均片段長(zhǎng)度880bp。經(jīng)RPKM法分析后共獲得29,878個(gè)DEGs。以corrected-pvalue≤0.05為閾值的代謝途徑有22條,其中大多數(shù)代謝途徑與植物的抗逆響應(yīng)密切相關(guān)。②153個(gè)DEGs參與了淀粉和蔗糖代謝途徑,DEGs主要是編碼糖類異構(gòu)

11、酶、水解酶和轉(zhuǎn)移酶等,參與葡糖糖水解、細(xì)胞碳水化合物、丙酮酸鹽和核苷酸代謝等生物進(jìn)程。③在抗氧化生物過程中,編碼活性氧代謝相關(guān)酶且差異倍數(shù)在5倍以上的DEGs有24個(gè),19個(gè)屬上調(diào)表達(dá)。表明活性氧代謝在杧果與病原互作過程中起到重要的調(diào)解作用。④F.mangiferae侵染杧果后,以差異倍數(shù)在10倍以上為篩選條件,共獲得酚類代謝相關(guān)差異表達(dá)基因53個(gè),其中40個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá),推測(cè)杧果可能是通過合成加固細(xì)胞壁的木質(zhì)素或生成抑菌作用的酚類