果梅ISSR標(biāo)記與遺傳多樣性分析.pdf

1、果梅(Prunus mume Sieb．et Zucc.)隸屬薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬(Prunus L.)，原產(chǎn)于中國。果梅是我國南方重要外銷型創(chuàng)匯果樹，外銷出口的比例很大，廣東主產(chǎn)區(qū)近年來產(chǎn)量的一半以上銷往境外。我國果梅栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，長期天然雜交和傳統(tǒng)生產(chǎn)上的實(shí)生繁殖，使現(xiàn)存種質(zhì)資源和人工栽培品種的遺傳背景十分復(fù)雜，同物異名、同名異物現(xiàn)象嚴(yán)重。為了更好地保存和利用這些種質(zhì)資源，我們利

2、用簡單重復(fù)序列間區(qū)(ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)對果梅遺傳多樣性進(jìn)行分析，研究結(jié)果如下： 1果梅基因組DNA提取的探討為從頑拗植物果梅葉片中獲得可供后續(xù)分子生物學(xué)操作的基因組DNA，針對其組織細(xì)胞中寓含多糖、多酚、有機(jī)酸等物質(zhì)的特點(diǎn)，采用改良CTAB法提取果梅基岡組DNA。在研磨前加入適量PVP和2％β-巰基乙醇，以防止酚氧化成醌，避免褐變；在核裂解之前先破碎細(xì)胞，將細(xì)胞質(zhì)中的次生物質(zhì)去除后再裂解細(xì)胞核；用高濃度的CTAB/NaCl溶

3、液與氯仿/異戊醇共沉淀有效去除多糖等措施，經(jīng)A260和A280值的測定，以及電泳檢測和PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明改良CTAB法所提取的DNA無論在純度上、完整性上都比改良的SDS法和傳統(tǒng)的CTAB法好。 2果梅ISSR反應(yīng)體系的建立對影響ISSR擴(kuò)增反應(yīng)的主要因子采用兩種方法進(jìn)行優(yōu)化：一為正交設(shè)計(jì)法；二為單因素逐項(xiàng)優(yōu)化方法。建立了果梅最佳ISSR反應(yīng)體系，即在20 μL反應(yīng)體系中含2μL 10×buffer、2.5 mmol/L Mg

4、Cl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.32 μmol/L 引物、20-80ng模板DNA、1U Taq DNA聚合酶。最佳反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，47.1℃-54.3℃(退火溫度隨引物不同而定)45 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次；72℃最后延伸7 min，4℃保存。 3果梅遺傳多樣性分析(1)多態(tài)性分析從51條ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰，穩(wěn)定性好的10條引物共擴(kuò)增出120個位點(diǎn)

5、，平均每個引物擴(kuò)增出12個位點(diǎn)，DNA片段大小分布在0.2-3.0kb之間。 不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性也存在較人的差異，擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)的范圍為8-12條，每個引物檢測劍的多態(tài)位點(diǎn)平均為9.8個。 (2)聚類分析 39個果梅品種的遺傳相似性分析(Jaccard系數(shù))表明，各基因型間的Jaccard相似系數(shù)在0.5263-0.9910之間。通過非加權(quán)算術(shù)平均數(shù)聚類(UPGMA)法，繪制了39個果梅品種遺傳關(guān)系樹狀圖。以0.65為閾值