副結(jié)核分枝桿菌SOD基因的克隆及原核表達.pdf

1、副結(jié)核病(Bovine Paratuberculosis)是由副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis)引起的一種全球性以反芻動物為主的慢性、消耗性傳染病，也稱Johne's。該病主要引起牛、羊、鹿等反芻動物慢性、增生性腸炎，導(dǎo)致頑固性腹瀉及慢性消耗，以致死亡。此外，也可引起豬、馬等非反芻動物發(fā)病，現(xiàn)已成為飼養(yǎng)業(yè)嚴(yán)重流行的傳染病之一。而且美國學(xué)者已從人類的克隆氏病患者體內(nèi)分離出M.paratubercu

2、losis。因此，Johne's病愈來愈引起了世界各國的廣泛關(guān)注。目前，預(yù)防該病的主要措施是控制傳染源和加強飼養(yǎng)管理，即以副結(jié)核PPD進行檢疫，對檢出的陽性牛進行隔離與淘汰。此外，國內(nèi)外也有采用預(yù)防接種的方法來控制該病，即將M. paratuberculosis熱滅活或致弱后制成疫苗，免疫接種牛和羊，可降低該病的發(fā)生率。但是疫苗接種后會使動物血清轉(zhuǎn)為陽性，干擾變態(tài)反應(yīng)和血清學(xué)檢測，并且在注射部位有時產(chǎn)生肉芽腫，以及對結(jié)核菌素敏感，妨礙牛

3、結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)檢測，影響了牛的檢疫和國際貿(mào)易。因此，許多政府禁止使用副結(jié)核菌苗及BCG來控制牛副結(jié)核病和結(jié)核病。可見，研究開發(fā)副結(jié)核病的新型疫苗和診斷試劑已迫在眉睫。 研究表明，在短期培養(yǎng)過程中，副結(jié)核分枝桿菌分泌具有免疫活性的蛋白質(zhì)，而在長期培養(yǎng)則相反。因此，早期分泌蛋白是主要的保護性抗原。由于DNA疫苗能有效地刺激機體產(chǎn)生持久的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時，DNA疫苗免疫后，不干擾副結(jié)核病和牛結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)檢測。因此，研

4、究新型DNA疫苗為預(yù)防副結(jié)核病提供了一條新途徑。 為了研制副結(jié)核病敏感、特異的診斷試劑和新型、高效的預(yù)防制劑，尤其是DNA疫苗，本研究篩選了M. paratuberculosis主要保護性抗原SOD基因，以M.paratuberculosis C-2染色體DNA為模板，以SOD基因的特異性引物進行PCR擴增，獲得了624bp的SOD基因，通過T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T Vector中，以質(zhì)粒大小、酶切分析、

5、PCR擴增及序列分析鑒定重組克隆，成功地構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pMD18-T-SOD，序列測定及DNASTAR分析表明，所獲得的M. paratuberculosisC-2 SOD基因與Gen Bank中M. paratuberculosis K-10 SOD基因的大小完全一致，兩者核苷酸序列的同源性為99％，氨基酸序列的同源性為99.5％，表明該基因在副結(jié)核分枝桿菌中是高度保守的。進一步將pMD18-T-SOD中的SOD基因亞克隆至pET-2