禽源鮑曼不動桿菌的分離鑒定與OmpA蛋白的原核表達及其初步應(yīng)用.pdf

1、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii,Ab）是醫(yī)院內(nèi)分離率位居第二的常見于人類感染的非發(fā)酵菌。其常會造成嚴(yán)重的醫(yī)院內(nèi)感染，包括皮膚和軟組織的感染、傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎、呼吸機相關(guān)性肺炎和菌血癥等并導(dǎo)致人類死亡。然而對于動物源鮑曼不動桿菌引起的動物感染或者帶菌情況的報道遠遠沒有人類多，尤其禽類感染鮑曼不動桿菌的情況鮮有報道，故探明其在禽類的感染率或者有否人源菌株感染禽類等流行病學(xué)情況具有重要的現(xiàn)實和公

2、共衛(wèi)生意義。本課題首次開展了不動桿菌在家禽中感染情況的調(diào)查研究，并對流行菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。此外，通過對外膜蛋白A（Omp A）進行原核表達，分析其免疫原性，并基于此建立了間接ELISA方法，以及進行了初步應(yīng)用。
　　本研究對2014年9月至2015年10月的發(fā)病蛋雞的肝臟、脾臟、肺、氣管和十二指腸等450份病料進行鮑曼不動桿菌的分離鑒定。對分離菌進行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特性的觀察、生化試驗、藥敏試驗、小鼠致病性試驗和特異性基因檢測

3、，結(jié)果共分離到2株鮑曼不動桿菌，流行率僅0.44％（95%CI,0.1-1.6）。2株鮑曼不動桿菌均對多種抗生素耐藥，且對小鼠有較強的致病性，LD50均達到7.09×107CFU/0.5mL。這為研究鮑曼不動桿菌對禽類的致病性以及其感染的流行情況等提供了材料基礎(chǔ)。
　　為了更好的認(rèn)識禽源鮑曼不動桿菌的遺傳進化地位及其溯源，本研究基于管家基因recA、gyrB、rpoB結(jié)合16S rRNA基因?qū)?株禽源分離株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表

4、明，進化樹分析發(fā)現(xiàn)2株禽源分離株與人源鮑曼不動桿菌遺傳距離最近，與大腸桿菌遺傳距離最遠，核苷酸同源性分析顯示禽源分離菌核苷酸同源性均與人源鮑曼不動桿菌的最高，高達92%-99.9%。以上結(jié)果說明禽源分離菌可能由人源菌株進化而來，這顯示了重要的公共衛(wèi)生意義。證明了recA、gyrB、rpoB基因聯(lián)合16S rRNA基因可用于不動桿菌屬菌種鑒定，探索了一種鑒定該菌的新方法。
　　通過設(shè)計特異性引物，擴增Omp A基因，克隆至原核表達載

5、體pET28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Omp A，轉(zhuǎn)化至BL21菌體進行誘導(dǎo)表達。通過條件摸索，確定最佳誘導(dǎo)條件，之后采用瓊脂糖Ni柱純化重組蛋白，并對其進行Western blot分析。SDS-PAGE結(jié)果表明，在37℃經(jīng)0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h的條件下，重組菌株能表達出約41kDa的融合蛋白，與預(yù)期大小一致。Western blot分析顯示，該融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。以上結(jié)果為進一步建立快速簡便的免疫學(xué)檢