水稻T-DNA插入突變體庫側翼序列的分離和OsBClL家族基因的功能研究.pdf

1、隨著水稻基因組測序的完成,水稻基因組學研究已經步入功能基因組學時代。為了在基因組或系統水平上全面分析水稻基因的功能,最直接有效的方式是構建大量的突變群體,然后利用正向遺傳學或反向遺傳學策略進行基因功能的研究。對于T-DNA或轉座子等插入型突變體的基因克隆,無論采用正向遺傳學方法或采用反向遺傳學方法,都必須分離插入位點的側翼序列。通過建立側翼序列數據庫,人們可以很容易地檢索到目的基因的突變體,從而進行基因克隆。
　　 本研究以本實

2、驗室的T-DNA插入突變體庫為材料,完成了12,432份T0代轉基因植株的PCR陽性檢測工作,利用TAIL-PCR技術分離得到T-DNA插入位點側翼序列5,082條。COBRA-like蛋白在植物纖維素合成和細胞擴張中具有重要的作用,本研究采用正向遺傳學與反向遺傳學相結合的方法,研究鑒定了水稻中兩個COBRA-like基因OsBC1L4和OsBC1L5的生物學功能。本研究還克隆了一個影響水稻分蘗數的基因LTW1并進行了功能分析。

3、　　 本研究獲得的主要研究結果如下:
　　 1.完成12,432份水稻T-DNA插入突變體庫TO代轉基因植株的PCR陽性檢測工作,其中10,770個家系為T-DNA插入陽性植株,T-DNA陽性率約為86.6％。
　　 2.對T-DNA插入陽性的家系分離側翼序列,共計得到T-DNA插入位點側翼序列5,082條,其中的2,644條序列與水稻基因組匹配較好(E-value<10-5),基因組定位率約為52.0％。
　　

4、 3.通過對分蘗突變表型的正向篩選,獲得2個T-DNA側翼序列和分蘗突變性狀共分離的家系04Z11EM13(OsBC1L4)和LTW1。
　　 4.對水稻OsBC1L家族成員進行了分子特征、染色體位置、系譜關系及表達分析,并通過反向遺傳學策略,搜集了5個OsBC1L基因的插入家系,發(fā)現OsBC1L5基因參與水稻花粉的發(fā)育。
　　 5.在04Z11EM13家系中,T-DNA插入到OsBC1L4基因的第4個外顯子中,造成了

5、分蘗少、矮化的突變表型。通過共分離檢測和互補實驗克隆了OsBC1L4基因。經光學顯微鏡和掃描電鏡觀察,發(fā)現osbc1l4突變體具有不正常的細胞擴張、降低的次生壁厚度和增力的淀粉積累。通過測定纖維素和木質素含量,發(fā)現osbc1l4突變體的纖維素含量下降了24％。采用RT-PCR和組織原位雜交技術分析了OsBC1L4基因的表達模式,發(fā)現該基因在薄壁組織和厚壁組織都有表達。通過進行OsBC1L4蛋白的亞細胞定位,發(fā)現該蛋白主要位于細胞壁和細胞

6、膜上。通過表達相關性分析,發(fā)現OsBC1L4基因與初生壁形成相關的纖維素合成酶基因共表達。用real-time方法檢測了纖維素合成相關基因和OsBC1L基因在osbc1l4突變體與野生型中的表達量,發(fā)現纖維素合成相關基因的表達在osbc1l4突變體中升高了,這可能反映了纖維素合成過程中的一種反饋機制,即通過升高其它纖維素合成相關基因的表達來彌補osbc1l4突變體中的纖維素損失。
　　 6.在OsBC1L5家系中,T-DNA插入

7、到OsBC1L5基因的唯一的外顯子中。該Tos17插入家系無純合單株。通過雜合植株與野生型植株的正反雜交,發(fā)現osbc1l5基因型的雄配子缺陷。經體外花粉萌發(fā)實驗,發(fā)現OsBC1L5基因可能參與水稻花粉的萌發(fā)。通過RNAi抑制實驗,發(fā)現OsBC1L5基因對水稻花粉壁的發(fā)育可能也有影響。
　　 7.在LTW1家系中,T-DNA插入到LTW1基因的唯一的外顯子中,造成了分蘗少、易枯萎的突變表型。通過共分離檢測和互補實驗克隆了LTW1