水稻T-DNA插入突變體庫及其Enhancer trap 系的創(chuàng)建.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學博士學位論文水稻TDNA插入突變體庫及其Enhancertrap系的創(chuàng)建姓名：吳昌銀申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導(dǎo)教師：張啟發(fā)20031101水稻TDNA插入突變體庫及其Enhancertrap系的創(chuàng)建中文摘要在植物功能基因組研究中，突變體對基因功能的闡釋具有重要作用。水稻是重要的糧食作物，由于其基因組較小、遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟、精細的物理圖譜，積累了大量cDNA序列及全基因組測序框架圖的完成而成為禾本科作物研

2、究的模式植物。構(gòu)建水稻突變體庫對于水稻功能基因組研究具有重要的意義。Enhancertrap技術(shù)作為功能基因組研究的有力工具，它往往以T—DNA為載體將Enhancertrap元件隨機插入到植物基因組中創(chuàng)建植物Enhancertrap系，通過檢測不同Enhancertrap系中報告基因的表達模式來發(fā)掘新基因及其調(diào)節(jié)序列。本研究首次引入了一種帶有GAL4／VPl6UAS的Enhancertrap系統(tǒng)，運用于水稻Enhancertrap系的

3、創(chuàng)建。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，旨在構(gòu)建水稻TDNA插入的Enhancertrap突變體庫。該突變體庫正用于基因調(diào)節(jié)序列的分離，喪失功能突變體的篩選及作為基因表達的模式系創(chuàng)造獲得的功能的突變體。獲得的主要研究結(jié)果如下：1建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻品種“中花11號”和“中花15號”高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，抗性愈傷率為70％一80％，大約60％的抗性愈傷再生成植株。高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系為大規(guī)模創(chuàng)造水稻T—DNA插入突變體庫奠定了基礎(chǔ)。2總共獲得

4、兩個品種的34843個獨立轉(zhuǎn)化子，大約94％的轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測為陽性，Southernblot結(jié)果表明，平均每個轉(zhuǎn)化子含有20個TDNA拷貝，估計水稻基因組中有65505個位點己被TDNA標記。3組織化學檢測不同組織／器官(葉、葉鞘、穗軸、雄蕊、小穗軸、子房、稃、根等)表明，不同Enhancertrap系中報告基因GUS呈不同的表達模式，有的只在一個組織中表達，有的在多個組織中表達，有的在所有組織中均表達。4抽提葉片GUS為陽性的En

5、hancertrap系中的葉片總RNA，RT—PCR結(jié)果顯示GAL4／VPl6基因均有表達。組織原位雜交證明GAL4／VPl6基因與BOGUS基因呈相同的表達模式，且BOGUS基因的表達量高，說明該Enhancertrap系統(tǒng)在檢測基因表達上更為敏感。5Tl代家系GUS染色結(jié)果表明，大多數(shù)家系內(nèi)GUS基因表達的分離比例符合孟德爾3：1分離比，TI代GUS陽性植株已被Southernblot所證實，Enhancertrap系中T—DNA及