泡桐叢枝植原體質(zhì)粒基因pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4的功能分析.pdf

1、由植原體引起的泡桐叢枝病(PaWB)在我國(guó)分布廣泛，為害嚴(yán)重，是中國(guó)泡桐樹(shù)種上最嚴(yán)重的病害之一。泡桐叢枝病由種苗種根等無(wú)性繁殖材料和韌皮部取食的介體昆蟲(chóng)傳播，目前已鑒定的介體昆蟲(chóng)有茶翅蝽(Halyomorpha halys(St(a)gl))、煙草盲蝽(Crytopeltis tenuis(Reuter))和小綠葉蟬(Empoasca flavescens(Fabricius))。為了研究泡桐叢枝植原體質(zhì)粒的功能，進(jìn)一步明確泡桐叢枝病介

2、體昆蟲(chóng)-植原體之間的分子互作和介體昆蟲(chóng)的傳播特性，本論文對(duì)以下四個(gè)方面進(jìn)行研究。
　　 本研究從實(shí)驗(yàn)室保存的含泡桐叢枝植原體質(zhì)粒pPaWBNy-1的3.0 kb的克隆和感病泡桐組培苗中分離到蟲(chóng)傳相關(guān)基因pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4的親水性肽段編碼區(qū)，連接到原核表達(dá)載體。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，得到分子量約為15 kDa的His-ORF5和分子量約為38 kDa的GST-ORF4融合蛋白。純化融合蛋白，制備

3、了這兩個(gè)融合蛋白的兔抗體。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，制備的兩個(gè)抗體特異性好、靈敏度高，間接ELISA測(cè)定兩者的效價(jià)為1∶8100和1∶4096。
　　 利用制備的抗體，分析了pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4在不同材料的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在感病的泡桐組培苗和野外采集的感病泡桐中皆未檢測(cè)到兩基因的表達(dá)，而在飼毒的茶翅蝽中檢測(cè)到分子量約17 kDa的pPaWBNy-1-ORF5編碼蛋白和18 kDa的Pa

4、WBNy-2-ORF4編碼蛋白。推測(cè)pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4編碼蛋白參與介體昆蟲(chóng)茶翅蝽傳播泡桐叢枝植原體。利用原核表達(dá)的His-ORF5融合蛋白微注射茶翅蝽，制備了可用于體內(nèi)分子互作的蛋白樣本。以純化的His-ORF5融合蛋白作為探針，用Far Western blot試驗(yàn)在茶翅蝽胸腹部提取的蛋白中鑒定到分子量為52 kDa和36 kDa的兩個(gè)與pPaWBNy-1-ORF5編碼蛋白互作的茶翅蝽蛋白，而在

5、血淋巴提取的蛋白中鑒定到分子量為52 kDa的互作蛋白。對(duì)于這兩個(gè)蛋白序列的測(cè)定，將會(huì)有助于確定pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4編碼蛋白的功能，有助于進(jìn)一步理解泡桐叢枝植原體與介體昆蟲(chóng)茶翅蝽互作的分子機(jī)制。
　　 采集了北京中國(guó)林科院院內(nèi)泡桐林中的茶翅蝽，建立了北京茶翅蝽種群的穩(wěn)定飼養(yǎng)、飼毒和微注射的技術(shù)體系。使用網(wǎng)捕法和振落法采集了河南南陽(yáng)泡桐林和越冬場(chǎng)所的蝽象，一共采集了四種蝽象:茶翅蝽、麻皮蝽(E

6、rhtesina fullo(Thunberg))、珀蝽(Plautiafimbriata(Fabricus))和寬脛格蝽(Cappaea tibialis Hsiao et Cheng)，它們的數(shù)量分別為293、41、8和8頭。對(duì)越冬場(chǎng)所和泡桐林中的蝽象樣本分別提取DNA和蛋白。巢式和半巢式PCR檢測(cè)帶毒情況，在麻皮蝽和寬脛格蝽中沒(méi)有檢測(cè)到植原體;而越冬茶翅蝽的帶毒率為29.2％，泡桐林中茶翅蝽的帶毒率為16.7％。提取的茶翅蝽蛋白進(jìn)

7、行免疫印跡試驗(yàn)，能夠檢測(cè)到分子量約17 kDa的pPaWBNy-1-ORF5編碼蛋白表達(dá)。
　　 使用質(zhì)?；騌epA的引物進(jìn)行半巢式PCR檢測(cè)珀蝽中的植原體，發(fā)現(xiàn)一頭珀蝽檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)PCR產(chǎn)物克隆和測(cè)序，序列分析發(fā)現(xiàn)其與泡桐叢枝植原體的RepA同源性為99.4％。對(duì)陽(yáng)性珀蝽的蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，鑒定到一個(gè)分子量約18 kDa的pPaWBNy-2-ORF4編碼蛋白。以上結(jié)果證明該頭珀蝽攜帶泡桐叢枝植原體。珀蝽是否也是泡桐