家蠶核型多角體病毒ORF71和ORF54的功能研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）是專門感染家蠶（Bombyx mori）的雙鏈環(huán)狀DNA病毒.BmNPV（T3株）病毒全長128，413個核苷酸，編碼136個開放閱讀框(ORFs).本研究以BmNPV兩個非核心基因ORF71和ORF54為研究對象，構建了基因缺失型病毒，并研究了基因缺失病毒在細胞內的復制情況、對病毒形態(tài)的影響和對宿主幼蟲的感染力。主要結果如下:
　　 1.Bm71位于基因組66714-67517nt，全長804b

2、p，編碼267個氨基酸殘基的蛋白，預測分子量為30 kDa。在Bm71起始密碼子上游434、401、288nt處發(fā)現(xiàn)早期轉錄基序CAGT，在起始密碼子上游298、193、154nt處發(fā)現(xiàn)早期轉錄基序GATA，在295 nt處發(fā)現(xiàn)晚期轉錄基序TAAG.在終止密碼子下游490nt處發(fā)現(xiàn)poly(A)加尾信號AATAAA.Bm71氨基酸序列沒有預測到信號肽序列和跨膜區(qū)，但是在第116、190氨基酸處檢測到N糖基化位點（N-glycosylat

3、ion sites）和第177氨基酸處的PKC磷酸化位點(Kinase specificphosphorylation sites).并且，Bm71氨基酸序列含有鋅指結構域和亮氨酸拉鏈，此外還有一個堿性區(qū)域和一個酸性區(qū)域.預測該蛋白在宿主或病毒感染過的細胞中的亞細胞定位為宿主細胞的細胞質。
　　 2.Bm71基因起始密碼子下游426bp的位置有一個PstⅠ酶切位點，用λRed同源重組方法將氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）插入該酶切

4、位點，使Bm71基因不能正常轉錄和表達，并利用Tn-7轉座重組將綠色熒光蛋白基因egfp和多角體蛋白基因ph重組到BmNPVbacmid的ph位點，從而成功構建了Bm71基因敲除病毒.
　　 3.Bm71敲除病毒可以感染家蠶細胞，但是產生的BV滴度大大降低.與野生型病毒相比，Bm71敲除病毒殺死家蠶五齡幼蟲的時間延長了約7.5個小時.而Bm71基因的異位補回能夠拯救這種缺陷。Bm71敲除病毒感染的細胞內能夠產生正常形態(tài)的核衣殼和

5、多角體.
　　 4.Bm54 ORF全長2，418bp，位于基因組50462-52879nt，編碼分子量為93 kDa、等電點pI為5.30的蛋白。在Bm54 ORF起始密碼子上游25和217nt處發(fā)現(xiàn)兩個桿狀病毒晚期轉錄基序(TAAG)，暗示Bm54可能是個晚期轉錄基因.另外，在終止密碼子下游299nt處發(fā)現(xiàn)一個典型的poly(A)加尾信號（AATAAA）.對Bm54氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)沒有信號肽、核定位信號以及跨膜結構域

6、存在。但是Bm54氨基酸序列含有一個desmoplakinN-terminus domain.
　　 5.Bm54的轉錄時相和表達時相分析結果表明，該基因的轉錄產物從3 hp.i.到72 h p.i.均可以檢測到，表明Bm54是一個從早期到晚期轉錄的基因.Bm54蛋白的表達從6 h p.i.可以檢測到并持續(xù)高表達到感染后期。
　　 6.Bm54蛋白亞細胞定位結果顯示，在感染后72 h，熒光集中在感染細胞的細胞質中，細胞核

7、也有微弱熒光，說明Bm54基因產物主要定位在細胞質，與前面序列分析結果一致。Bm54蛋白在病毒結構中的定位分析表明，該蛋白是ODV結構組分，定位于ODV的囊膜。
　　 7.用948 bp的cat基因替換Bm54 ORF上一段519 bp的區(qū)域，從BmNPV基因組敲除Bm54基因，Bm54上游的835 bp和下游的1，065 bp則保留下來以免影響B(tài)m54上下游基因的轉錄.
　　 8.Bm54基因敲除后不能產生有感染力的B