家蠶細小病毒樣病毒VD2-ORF1基因的表達和分析.pdf

1、家蠶細小病毒樣病毒(Bombyx mori parvo-like virus china isolate,BmPLV)是首例動物二分病毒,病毒粒子表面無囊膜包裹,衣殼呈二十面體對稱。BmPLV與細小病毒相比有三個顯著的特征:一是該病毒的基因組為兩個單鏈DNA分子(VD1,VD2),這兩種核酸分子以單鏈線型方式(+VD1、-VD1、+VD2、-VD2)被分別包埋在各自的衣殼蛋白中；二是VD1和VD2末端擁有53 nt的共有序列,并且其末端

2、的反向重復序列不形成回文結構；三是基因組具有編碼DNA聚合酶的結構域。病毒結構蛋白的性質和組成決定了病毒衣殼結構及病毒粒子侵染特性,部分結構蛋白還能參與到病毒基因組的復制中。
　　 家蠶細小病毒樣病毒中國株(BmPLV-Z)VD2-ORF1,由3483 nt組成,編碼病毒的結構蛋白,理論分子量為133 kDa,我們將其命名為P133。在細小病毒中,編碼能力較強的衣殼蛋白基因會通過漏掃描或可變剪接等方式來產生多種結構蛋白,而不會直

3、接產生分子量如133 kDa般大的結構蛋白。為了鑒定VD2-ORF1編碼133 kDa的結構蛋白和了解P133在宿主細胞中的表達時相,本研究通過對VD2-OR目的3’末端933bp和5’末端1020 bp進行了克隆表達,并制備了P133N與P133C多克隆抗體,利用該抗體檢測了病毒粒子中的結構蛋白P133,并對病毒結構蛋白P133在宿主體內的表達進行了研究,取得的研究成果如下:
　　 1.P133氨基酸序列分析及相似性比對

4、>　　 通過NCBI Blastp軟件,搜索結構蛋白P133相似性序列,結果顯示,有六條同源序列,這六條同源序列均來自于呼腸孤病毒的結構蛋白。多序列比對結果顯示,P133蛋白與這六種病毒的結構蛋白C端是具有相似性,而這些結構蛋白的C端都具有一些功能結構域,如CoCPV VP3的DNA結合序列。同時,絲氨酸蛋白酶與銅轉運蛋白的C末端也與P133的C端有相似性。
　　 2.P133 C端與N端的原核表達與多克隆抗體的制備
　

5、　 構建原核表達載體pET-28a-P133N和pET-28a-P133C,轉化E.coli BL21菌株,利用IPTG誘導表達目的蛋白。Western blot與質譜鑒定結果顯示,成功表達了家蠶細小病毒樣病毒中國株(BmPLV-Z)P133的C端340 aa及N端311 aa的融合多肽。Ni-NTA純化融合蛋白,分別制備了P133C和P133N多克隆抗體。
　　 3.病毒粒子中結構蛋白P133的鑒定
　　 分離純化B

6、mPLV-Z病毒粒子,SDS-PAGE分離病毒粒子結構蛋白,利用制備的P133C和P133N抗體分別對病毒粒子結構蛋白進行western blot分析。結果顯示,這兩種抗體在病毒粒子結構多肽中識別的蛋白條帶大小相同,約133 kDa,證實P133確是病毒VD2-ORF1編碼的結構蛋白；并且表明VD2-ORF1編碼單一的結構蛋白。
　　 4.病毒結構蛋白在中腸組織中的表達鑒定.
　　 以感染病毒不同時間點的家蠶中腸組織為樣