人類基因C4orf13、CDK5RAP1_v3、CDK5RAP1_v4和PXK的克隆和功能研究.pdf

1、從大規(guī)模的胎腦組織cDNA克隆和測序計(jì)劃中，本文通過生物信息學(xué)分析選取了4條全長cDNA進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以探討這些基因的功能及其與人類疾病的關(guān)系。 分離到的人類新基因C4orf13cDNA全長2706bp，編碼一個(gè)340氨基酸的多肽，其含有一個(gè)典型的SBF結(jié)構(gòu)域(SBF，SodiumBileacidcotransporterfamily)和十個(gè)可能的跨膜區(qū)段。假定的蛋白C4orf13顯示了與在大鼠和非洲爪蟾中同源蛋白高度的相

2、似性。人類基因C4orf13定位于染色體4q31.2并含有12個(gè)外顯子。RT-PCR結(jié)果表明人類基因C4orf13在成人組織中廣譜表達(dá)，其中在肝臟和肺組織中的表達(dá)水平相對較高，在胎盤、腎臟、脾臟和胸腺組織中的表達(dá)水平居中，在心臟、前列腺和睪丸組織中的表達(dá)水平較低。表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示人類新基因C4orf13在胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)。 兩個(gè)人類基因CDK5RAP1新的剪切體，CDK5RAP1_v3和CDK5RAP1_v1被成功地從

3、胎腦文庫中克隆出來。CDK5RAP1_v3和CDK5RAP1_v4的cDNA分別長1923bp和1792bp。序列分析表明CDK5RAP1_v4相對CDK5RAP1_v3缺少了一個(gè)外顯子，這導(dǎo)致這兩種cDNA編碼不同的蛋白。推斷的蛋白分別含有574個(gè)氨基酸(CDK5RAP1_v3)和426個(gè)氨基酸(CDK5RAP1_v4)，它們具有共同的N-端420個(gè)氨基酸殘基。RT-PCR分析的結(jié)果顯示人類CDK5RAP1_v3廣泛地在成人組織中表達(dá)

4、。CDK5RAP1_v3的表達(dá)水平在胎盤和肺組織中相對較高，而在心臟、大腦、肝臟、骨骼肌、胰臟、脾臟、胸腺、小腸和外周血淋巴組織中表達(dá)水平較低。相對來說，CDK5RAP1_v4主要在大腦、胎盤和睪丸組織中表達(dá)。 PX(Phoxhomology)結(jié)構(gòu)域特異性地與磷脂酰肌醇脂質(zhì)結(jié)合，這一結(jié)合對于它們的細(xì)胞功能是關(guān)鍵的。一條全長的人類PXK基因(humanPXdomaincontainingserine/threoninekinas

5、egene)cDNA以前曾經(jīng)被克隆出來，本文將其命名為PXK_v1。PXK_v1含有一個(gè)S_TKc結(jié)構(gòu)域(serine/threoninekinases，catalyticdomain)，但是缺少了幾個(gè)對于催化活性絕對必要的幾個(gè)氨基酸殘基。目前的研究表明在人類胎腦組織中至少存在人類PXK基因四種其它的不同剪切體，將其分別命名為PXK_v2，PXK_v3，PXK_v4及PXK_v5。RT-PCR結(jié)果顯示了人類PXK_v1，PXK_v2及P

6、XK_v4轉(zhuǎn)錄本在成人組織中除了心臟之外廣泛表達(dá)。相對地，PXK_v3轉(zhuǎn)錄本僅僅在外周血淋巴組織中低水平表達(dá)而PXK_v5轉(zhuǎn)錄本不能被檢測到。將PXK_v1或PXK_v2基因的讀框克隆入pET32a載體，在大腸桿菌Rosette(DE3)菌株中獲得表達(dá)后我們純化了蛋白。對PXK_v1或PXK_v2的激酶活性測定中未檢測到酶活性。序列分析結(jié)合酶活測定，本文推測PXK蛋白為假激酶。EGFP-PXK融合蛋白在COS7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析表明

7、PXK_v3具有與其它PXK蛋白異構(gòu)體不同的亞細(xì)胞定位。根據(jù)在COS7細(xì)胞中突變分析EGFP-PXK_v1的亞細(xì)胞定位結(jié)果，推斷PXK_v1-Tyr56與Arg92對EGFP-PXK_v1在COS7細(xì)胞的亞細(xì)胞定位中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。過表達(dá)試驗(yàn)表明，PXK基因五種剪切體對COS7細(xì)胞的增殖有不同程度的影響。此外，PXK基因五種剪切體在COS7細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)均能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。采用酵母雙雜交系統(tǒng)尋找與PXK_v1或PXK_v2相互作用的蛋白，