人類基因C4orf13、CDK5RAP1_v3、CDK5RAP1_v4和PXK的克隆和功能研究.pdf

1、從大規(guī)模的胎腦組織cDNA克隆和測序計劃中，本文通過生物信息學分析選取了4條全長cDNA進行進一步的研究，以探討這些基因的功能及其與人類疾病的關系。 分離到的人類新基因C4orf13cDNA全長2706bp，編碼一個340氨基酸的多肽，其含有一個典型的SBF結構域(SBF，SodiumBileacidcotransporterfamily)和十個可能的跨膜區(qū)段。假定的蛋白C4orf13顯示了與在大鼠和非洲爪蟾中同源蛋白高度的相

2、似性。人類基因C4orf13定位于染色體4q31.2并含有12個外顯子。RT-PCR結果表明人類基因C4orf13在成人組織中廣譜表達，其中在肝臟和肺組織中的表達水平相對較高，在胎盤、腎臟、脾臟和胸腺組織中的表達水平居中，在心臟、前列腺和睪丸組織中的表達水平較低。表達譜芯片結果顯示人類新基因C4orf13在胃癌組織中表達顯著上調(diào)。 兩個人類基因CDK5RAP1新的剪切體，CDK5RAP1_v3和CDK5RAP1_v1被成功地從

3、胎腦文庫中克隆出來。CDK5RAP1_v3和CDK5RAP1_v4的cDNA分別長1923bp和1792bp。序列分析表明CDK5RAP1_v4相對CDK5RAP1_v3缺少了一個外顯子，這導致這兩種cDNA編碼不同的蛋白。推斷的蛋白分別含有574個氨基酸(CDK5RAP1_v3)和426個氨基酸(CDK5RAP1_v4)，它們具有共同的N-端420個氨基酸殘基。RT-PCR分析的結果顯示人類CDK5RAP1_v3廣泛地在成人組織中表達

4、。CDK5RAP1_v3的表達水平在胎盤和肺組織中相對較高，而在心臟、大腦、肝臟、骨骼肌、胰臟、脾臟、胸腺、小腸和外周血淋巴組織中表達水平較低。相對來說，CDK5RAP1_v4主要在大腦、胎盤和睪丸組織中表達。 PX(Phoxhomology)結構域特異性地與磷脂酰肌醇脂質結合，這一結合對于它們的細胞功能是關鍵的。一條全長的人類PXK基因(humanPXdomaincontainingserine/threoninekinas

5、egene)cDNA以前曾經(jīng)被克隆出來，本文將其命名為PXK_v1。PXK_v1含有一個S_TKc結構域(serine/threoninekinases，catalyticdomain)，但是缺少了幾個對于催化活性絕對必要的幾個氨基酸殘基。目前的研究表明在人類胎腦組織中至少存在人類PXK基因四種其它的不同剪切體，將其分別命名為PXK_v2，PXK_v3，PXK_v4及PXK_v5。RT-PCR結果顯示了人類PXK_v1，PXK_v2及P

6、XK_v4轉錄本在成人組織中除了心臟之外廣泛表達。相對地，PXK_v3轉錄本僅僅在外周血淋巴組織中低水平表達而PXK_v5轉錄本不能被檢測到。將PXK_v1或PXK_v2基因的讀框克隆入pET32a載體，在大腸桿菌Rosette(DE3)菌株中獲得表達后我們純化了蛋白。對PXK_v1或PXK_v2的激酶活性測定中未檢測到酶活性。序列分析結合酶活測定，本文推測PXK蛋白為假激酶。EGFP-PXK融合蛋白在COS7細胞中的亞細胞定位分析表明

7、PXK_v3具有與其它PXK蛋白異構體不同的亞細胞定位。根據(jù)在COS7細胞中突變分析EGFP-PXK_v1的亞細胞定位結果，推斷PXK_v1-Tyr56與Arg92對EGFP-PXK_v1在COS7細胞的亞細胞定位中發(fā)揮了關鍵作用。過表達試驗表明，PXK基因五種剪切體對COS7細胞的增殖有不同程度的影響。此外，PXK基因五種剪切體在COS7細胞內(nèi)過表達均能促進細胞的凋亡。采用酵母雙雜交系統(tǒng)尋找與PXK_v1或PXK_v2相互作用的蛋白，