柑橘果實(shí)快速高效在線抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的建立及其應(yīng)用研究.pdf

1、人類許多疾病的發(fā)生與人體自身抗氧化活性系統(tǒng)能力的強(qiáng)弱存在著直接或間接的關(guān)系。同樣，食品的氧化變質(zhì)也和食品抗氧化活性密切相關(guān)。人體可以通過攝入抗氧化物質(zhì)來增強(qiáng)自身的抗氧化系統(tǒng)能力。在食品中可以通過添加人造或天然抗氧化物質(zhì)，來延長食品的保鮮期和貨架期。抗氧化物質(zhì)的種類包括人造抗氧化劑和天然抗氧化劑。人造抗氧化劑被質(zhì)疑可能會(huì)危害人體健康，其安全性長期以來具有較大爭議。所以尋找天然的抗氧化活性物質(zhì)和具有抗氧化活性的植物種類，成為目前抗氧化活性研

2、究的熱點(diǎn)。柑橘作為世界上最重要的果樹作物之一，其果實(shí)中許多生物活性物質(zhì)具有的抗氧化活性。到目前為止，已經(jīng)建立了許多檢測(cè)抗氧化活性的方法，例如DPPH、ABTS、FRAP、ORAC等離線法，以及HPLC-DPPH和HPLC-ABTS等在線法。然而離線法在一定程度上存在操作繁瑣，耗時(shí)耗力等問題;而已有的在線法側(cè)重于分析樣品中單個(gè)化合物的抗氧化活性研究，不能快速直接測(cè)定樣品的總抗氧化活性。但是樣品總抗氧化活性測(cè)定往往是許多研究的第一步。實(shí)現(xiàn)總

3、抗氧化活性快速化測(cè)定，對(duì)于抗氧化活性及其相關(guān)研究都具有重要的意義。因此，建立快速高效抗氧化活性分析檢測(cè)方法，將促進(jìn)抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)研究，有利于實(shí)現(xiàn)植物資源抗氧化活性系統(tǒng)快速地評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)食品抗氧化活性的快速檢測(cè)等都具有重要的意義。
　　本論文旨在建立和應(yīng)用快速高效在線抗氧化活性檢測(cè)方法。我們將高效液相色譜系統(tǒng)（英文全稱High Performance Liquid Chromatograpy，簡稱HPLC）和柱后不同自由基檢測(cè)系統(tǒng)

4、（英文全稱Free Radical Scavenger Detector，簡稱FRSD）聯(lián)用，并優(yōu)化了檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)條件。利用柱后系統(tǒng)研究兩種自由基（DPPH和ABTS自由基）的清除效果，以建立兩種抗氧化活性檢測(cè)方法（HPLC-DPPH-FRSD法和HPLC-AB S-FRSD法）。并對(duì)HPLC-FRSD在線抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。在上述工作的基礎(chǔ)上，本研究利用新在線HPLC-DPPH/ABTS-FRSD檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定了35個(gè)不

5、同基因型柑橘成熟果實(shí)的果皮、囊衣、種子和果汁的抗氧化活性，分別與離線DPPH法和ABTS法測(cè)定的抗氧化活性結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，評(píng)價(jià)在線HPLC-FRSD檢測(cè)系統(tǒng)在是否適用于不同基質(zhì)樣品抗氧化活性的快速測(cè)定。同時(shí)，我們還分析了在線HPLC-FRSD檢測(cè)系統(tǒng)是否能用于柑橘抗氧化活性與柑橘總酚總黃酮含量相關(guān)性研究。新的快速高效總抗氧化活性檢測(cè)方法的建立和已有在線HPLC抗氧化活性檢測(cè)方法比較，是一種技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)未來柑橘資源的評(píng)價(jià)和柑橘果品營

6、養(yǎng)學(xué)研究有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。論文主要研究結(jié)果如下:
　　1.在線HPLC-FRSD抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)的建立
　　1.1柑橘酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單體抗氧化活性的比較
　　為了篩選出作為新建在線HPLC-FRSD系統(tǒng)中的抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本章節(jié)通過DPPH法，ABTS法和FRAP法三種離線法，以及已經(jīng)報(bào)道的HPLC-DPPH法和HPLC-ABTS法測(cè)定了15種常見柑橘酚類物質(zhì)的抗氧化活性，并利用抗氧化活性綜合指數(shù)(Antioxi

7、dant potencycomposite，APC)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。
　　結(jié)果顯示15種柑橘酚類物質(zhì)的抗氧化活性順序（APC綜合評(píng)價(jià)指數(shù)，％）為:沒食子酸(92.32％)＞咖啡酸(85.29％)＞綠原酸(69.75％)＞阿魏酸(50.97％)＞圣草酚(39.38％)＞圣草次苷(39.36％)＞蘆丁(27.42％)＞橙皮素(4.88％)＞柚皮素(4.78％)＞地奧司明(3.24％)＞橙皮苷(2.33％)＞川陳皮素(1.18％)＞甜

8、橙黃酮(1.16％)、柚皮苷(1.16％)＞橘皮素(0.41％)。
　　基于上述結(jié)果，綜合考慮酚類物質(zhì)抗氧化活性強(qiáng)弱以及來源方便與否，選用蘆丁、阿魏酸、沒食子酸、綠原酸和咖啡酸共5種酚類物質(zhì)為抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于新在線HPLC-FRSD抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)建立。
　　1.2 HPLC-FRSD在線抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)優(yōu)化
　　為了建立新在線抗氧化活性檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的抗氧化活性快速測(cè)定，本論文通過對(duì)HPLC-FRSD在

9、線抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)條件的優(yōu)化，最終確立HPLC-DPPH/ABTS-FRSD法分析檢測(cè)的條件如下:
　　(1) HPLC分析系統(tǒng):配有Waters XTerra MS C18保護(hù)柱芯(3.9×20 mm，5μm);流動(dòng)相:A為0.1％（V醋酸∶V水=1∶999）醋酸水溶液，B為甲醇;等度洗脫程序條件:37％A，63％B;流速:0.91 mL min-1;保護(hù)柱柱溫:30℃;進(jìn)樣體積25μL; PAD檢測(cè)波長:2D通道分別設(shè)置28

10、3 nm和245 nm。(2)柱后分析系統(tǒng):DPPH自由基溶液(0.2 mM)或ABTS自由基溶液（400 nm處吸光度為0.70±0.02 AU時(shí)的濃度）引入流速均為0.80 mL min-1。DPPH自由基溶液檢測(cè)波長517 nm; ABTS自由基溶液檢測(cè)波長為400 nm;柱后自由基衍生反應(yīng)系統(tǒng)溫度為30℃。每個(gè)樣品抗氧化活性分析時(shí)間為5 min。(3)整個(gè)系統(tǒng)是由Waters EmpowerTM2 Chromatography（

11、美國Waters公司）數(shù)據(jù)分析軟件控制。(4)最后樣品抗氧化活性利用維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線以及換算成維生素C當(dāng)量進(jìn)行表示[mg g-1干重(DW)或mg L-1鮮重(FW)]。
　　1.3 HPLC-FRSD在線抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證
　　為了對(duì)新建立的HPLC-FRSD抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，我們利用蘆丁等酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單體對(duì)新系統(tǒng)的檢出限，定量限，回收率，重復(fù)性，精確性和穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。研究結(jié)果表明:我們建立的在線H

12、PLC-DPPH-FRSD和HPLC-ABTS-FRSD兩種檢測(cè)方法，均呈現(xiàn)很好的線性度(r＜0.999)，具有低的檢出限（0.001-0.010 mg mL-1）和定量限(0.005-0.020mg mL-1)，具有高的回收率(90.44-115.72％)，良好的重復(fù)性(RSD＜2％)、精密度(RSD＜2％)和穩(wěn)定性（7小時(shí)內(nèi)RSD＜15.80％）。有關(guān)參數(shù)驗(yàn)證結(jié)果完全符合方法學(xué)要求。
　　2.在線HPLC-FRSD系統(tǒng)應(yīng)用于柑

13、橘果實(shí)抗氧化活性測(cè)定的研究
　　為了研究在線HPLC-FRSD系統(tǒng)是否適用于柑橘樣品不同基質(zhì)抗氧化活性高效快速測(cè)定，我們用新建立的HPLC-DPPH/ABTS-FRSD方法測(cè)定8大種類共35個(gè)不同基因型柑橘成熟果實(shí)不同部位的抗氧化活性，并與離線DPPH法和ABTS法測(cè)定的柑橘抗氧化活性結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果表明，在線法和離線法用于柑橘果實(shí)抗氧化活性測(cè)定，兩者存在顯著相關(guān)性(P＜0.05)，在線抗氧化活性檢測(cè)方法適合柑橘不同基

14、質(zhì)樣品的快速高效抗氧化活性檢測(cè)。其中HPLC-ABTS-FRSD法適用于柑橘囊衣、種子、果汁快速抗氧化活性測(cè)定;HPLC-DPPH-FRSD法適用于柑橘果皮、種子、果汁快速抗氧化活性測(cè)定。在線HPLC-FRSD抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)可以快速和高通量測(cè)定不同基質(zhì)的柑橘樣品。
　　3.在線HPLC-FRSD系統(tǒng)應(yīng)用于柑橘果實(shí)抗氧化活性測(cè)定與總酚總黃酮含量相關(guān)性研究
　　柑橘果實(shí)的抗氧化活性，源于其所具有的抗氧化物質(zhì)。本文通過福林酚法

15、和氯化鋁顯色法分別測(cè)定了柑橘果實(shí)的總酚含量和總黃酮含量，進(jìn)一步研究了在線HPLC-FRSD系統(tǒng)是否適用于柑橘果實(shí)抗氧化活性測(cè)定與總酚總黃酮含量相關(guān)性研究。結(jié)果表明:HPLC-DPPH-FRSD法可以替代DPPH離線法應(yīng)用于柑橘果實(shí)抗氧化活性與總酚總黃酮含量相關(guān)性分析研究;HPLC-ABTS-FRSD法可以替代ABTS法應(yīng)用于柑橘果皮和果汁抗氧化活性與總酚總黃酮含量相關(guān)性研究。
　　4.柑橘果實(shí)不同部位抗氧化活性，總酚總黃酮含量測(cè)定

16、結(jié)果
　　4.135個(gè)不同基因型柑橘成熟果實(shí)不同部位抗氧化活性測(cè)定結(jié)果
　　抗氧化活性較高的柑橘果皮樣品包括:椏柑3號(hào)和牛腎柑;囊衣樣品包括:枸頭橙;種子樣品包括:枸頭橙、口之津15號(hào)（蜜可露）、卡拉橘;果汁樣品包括:嶺南沙田柚、專有橘、帕森橘（墨西哥）、白橘。抗氧化活性較弱的柑橘樣品包括沙柑的種子和果汁、郭2701-1黎檬的果汁、蘭卜株檬的果汁、囊衣和種子。一般來講，35個(gè)不同基因型柑橘成熟果實(shí)不同部位相比較，果皮和果汁的

17、抗氧化活性最高，柑橘果皮和果汁是潛在的柑橘果實(shí)主要抗氧化活性貢獻(xiàn)者。
　　4.235個(gè)不同基因型柑橘成熟果實(shí)不同部位總酚含量測(cè)定結(jié)果
　　果皮樣品總酚含量較高的有枸頭橙和代代;囊衣樣品總酚含量較高的有枸頭橙和代代;種子樣品總酚含量較高的有口之津15號(hào)（蜜可露）、卡拉橘、紅馬敘葡萄柚、槾橘、瑞紅葡萄柚;果汁樣品總酚含量較高的有牛腎柑、枸頭橙、椪柑3號(hào)和紅馬敘葡萄柚。
　　4.335個(gè)不同基因型柑橘成熟果實(shí)不同部位總黃酮含