基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、機(jī)體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過量自由基，可直接或間接損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，使機(jī)體的氧化與抗氧化平衡系統(tǒng)被打破，利用外源性抗氧化活性物質(zhì)對(duì)抗體內(nèi)過量自由基是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要手段。傳統(tǒng)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，因其各自的技術(shù)缺陷，嚴(yán)重制約著抗氧化活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。因此，亟需建立一種新的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法。細(xì)胞代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)分支，因其靈敏度高、選擇性好、快速、準(zhǔn)確性高、可控性強(qiáng)等多種優(yōu)點(diǎn)，可發(fā)展為一種新的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法。與化學(xué)評(píng)價(jià)方法相比較

2、，基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法以細(xì)胞為載體，未脫離生物體本身，更接近于生物體氧化反應(yīng)過程；與細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)方法相比較，基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法運(yùn)用細(xì)胞代謝組學(xué)研究方法，可全面反映細(xì)胞內(nèi)代謝物信息。本研究采用細(xì)胞代謝組學(xué)研究方法，以 HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，基于 HPLC-DAD-MS技術(shù)平臺(tái)，通過對(duì)細(xì)胞代謝物的分析，結(jié)合多種模式識(shí)別技術(shù)，獲取與抗氧化活性相關(guān)的代謝物靶標(biāo)，構(gòu)建基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，并應(yīng)用

3、該方法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)提取物。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　(1)細(xì)胞樣品前處理及HPLC分析方法的研究。為最大限度地提取代謝物并取得可靠的分析結(jié)果，對(duì)細(xì)胞樣品前處理及HPLC分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。細(xì)胞代謝物用﹣20 ℃預(yù)冷的60％甲醇淬滅、超聲波破碎、60%甲醇提取進(jìn)樣分析。HPLC色譜條件為：流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動(dòng)相為1.93 g/

4、L醋酸銨(pH=4.81)和乙腈；溶劑洗脫梯度為0.5-5%乙腈(0-10 min)、5-95%乙腈(10-60 min)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。
　　(2)基于細(xì)胞代謝組學(xué)的氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。通過MTT實(shí)驗(yàn)選擇5 mg/L H2O2作用4 h，100 mg/L VE作用24 h，250 mg/L GSH作用24 h建立氧化應(yīng)激模型。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平及酶活性驗(yàn)證氧化應(yīng)激模型。對(duì)細(xì)胞代謝物進(jìn)行HPLC分析，從典型的HP

5、LC-DAD譜圖中選取28個(gè)共有峰進(jìn)行模式識(shí)別分析，借助于OPLS-DA模型的S-plot圖及VIP值篩選出11種潛在的氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物。同時(shí)，采用LC-MS聯(lián)用技術(shù)得到潛在生物標(biāo)記物的精確相對(duì)分子質(zhì)量，通過細(xì)胞代謝物與對(duì)照品的紫外光譜圖、保留時(shí)間并結(jié)合加標(biāo)法對(duì)色譜峰定性，其中p1、p2、p3及p9分別鑒定為蘋果酸、VC、GSH及色氨酸。
　　(3)基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的建立。在 OPLS-DA模型基礎(chǔ)上，建立了

6、基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性定性評(píng)價(jià)方法。以VE或GSH的CMAA unit值為標(biāo)準(zhǔn)，定量評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性，建立了基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性定量評(píng)價(jià)方法。
　　(4)基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用。根據(jù)前期建立的細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)提取物，并運(yùn)用化學(xué)評(píng)價(jià)方法及細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，建立的基于細(xì)胞代謝組學(xué)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法是可靠的，且結(jié)果與傳統(tǒng)的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的結(jié)果一致。多種評(píng)