飼料中常見霉菌毒素對小鼠的聯(lián)合毒性作用及機(jī)制的研究.pdf

1、本試驗(yàn)在細(xì)胞水平和動物整體水平研究了黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、嘔吐毒素(DON)和伏馬菌素B1(FB1)四種霉菌毒素對豬腎細(xì)胞、大鼠肝細(xì)胞和小鼠的聯(lián)合毒性。
　　(1)對豬腎細(xì)胞(PK15)的聯(lián)合毒性
　　將AFB1、ZEA、DON和FB1以不同濃度與PK15孵育12，24和48h后，采用MTT法和LDH釋放法評價霉菌毒素的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明:AFB1、ZEA、DON與PK15孵育48h后，EC50

2、（50％效應(yīng)濃度）分別為38.8、121.8和3.6μM，EC30(30％效應(yīng)濃度)分別為26.9、86.6和1.8μM。且AFB1和ZEA均呈現(xiàn)時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著劑量增加和時間延長，霉菌毒素的細(xì)胞毒性增強(qiáng)。FB1濃度高達(dá)250μM且孵育48h后，PK15細(xì)胞活力仍大于70％。與霉菌毒素孵育24h后，AFB1、ZEA和DON能顯著提高細(xì)胞LDH的釋放，而FB1顯著降低細(xì)胞LDH的釋放。AFB1和DON均能顯著提高細(xì)胞內(nèi)活性氧和

3、細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)，而ZEA(10，20，40μM)對細(xì)胞內(nèi)活性氧和細(xì)胞凋亡沒有影響。四種霉菌毒素的細(xì)胞毒性大小順序?yàn)镈ON＞AFB1＞ZEA＞FB1。
　　以每種霉菌毒素EC30作為中心點(diǎn)（其中FB1濃度為15μM），設(shè)計(jì)二元和三元混合，依據(jù)劑量和效應(yīng)進(jìn)行逐步回歸得到擬合方程，根據(jù)擬合方程中各系數(shù)的含義表明:AFB1和ZEA(暴露48h)、AFB1和DON(暴露12h)、及ZEA和DON(暴露12和48h)對PK15的毒

4、性表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng);AFB1和FB1聯(lián)合作用僅表現(xiàn)AFB1的細(xì)胞毒性。AFB1、ZEA和DON三者聯(lián)合作用12或24h后，AFB1與ZEA表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。
　　ZEA能緩解低濃度AFB1(1μM)誘導(dǎo)的細(xì)胞膜損傷和氧化損傷，但10μMZEA與高濃度AFB1（5，10μM）能協(xié)同加劇細(xì)胞膜損傷和氧化損傷。10μMZEA主要能緩解由AFB1(1μM)誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡，可能是通過調(diào)控bcl-2和caspas-3及P53基因或蛋白的表達(dá)。

5、
　　(2)對大鼠肝細(xì)胞(BRL)的聯(lián)合毒性
　　將AFB1、ZEA、DON和FB1以不同濃度與BRL孵育12，24和48h后，采用MTT法和LDH釋放法評價霉菌毒素的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明:AFB1、ZEA、DON與BRL孵育48h后，EC50分別為37.9、100.3和13.3μM，EC30分別為29.2、91.6和3.27μM，160μM FB1基本不影響細(xì)胞活力。與霉菌毒素孵育24h后，AFB1、ZEA和DON能顯著提高

6、細(xì)胞LDH釋放率，而FB1不影響細(xì)胞LDH的釋放。AFB1和DON均能顯著提高細(xì)胞內(nèi)活性氧和細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)，但ZEA(10，20，40μM)對細(xì)胞內(nèi)活性氧和細(xì)胞凋亡率沒有影響。四種霉菌毒素對BRL的細(xì)胞毒性大小順序?yàn)镈ON＞AFB1＞ZEA＞FB1。
　　以每種霉菌毒素EC30為中心點(diǎn)（其中FB1的濃度為15μM），設(shè)計(jì)二元和三元混合，根據(jù)劑量和效應(yīng)進(jìn)行逐步回歸得到擬合方程，根據(jù)擬合方程中各系數(shù)的含義表明:AFB1和Z

7、EA(暴露48h)，及AFB1和DON(暴露12，24，48h)對BRL的毒性表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng);AFB1和FB1聯(lián)合作用僅表現(xiàn)AFB1的毒性。AFB1、ZEA和DON三者聯(lián)合作用12、24和48h，AFB1與DON表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。
　　AFB1與DON聯(lián)合在細(xì)胞膜損傷和氧化損傷上表現(xiàn)為加型或協(xié)同效應(yīng)。1μM AFB1與2μM DON聯(lián)合能協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能是通過降低bcl-2、促進(jìn)bax和caspase-3及P53基因或蛋白的表

8、達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程。
　　(3)對Balb/C小鼠的聯(lián)合毒性
　　104只體重一致的4周齡雌性Balb/C小鼠適應(yīng)一周后，隨機(jī)分為13組，每組8只。具體分組如下:蒸餾水組、DMSO組、乙醇組、AFB1(2.5mg/kg.bw)、ZEA(5mg/kg.bw)、DON(5mg/kg.bw)、FB1(8mg/kg.bw)單一處理組及AFB1+ZEA、AFB1+DON、AFB1+FB1、ZEA+DON、ZEA+FB1和DON+FB

9、1聯(lián)合處理組。聯(lián)合組劑量采用單一劑量疊加，連續(xù)灌胃14d。
　　霉菌毒素對Balb/C小鼠體增重不存在聯(lián)合作用。FB1能顯著提高脾臟重，含有FB1的聯(lián)合組能減弱由FB1導(dǎo)致的脾臟增重。AFB1和DON能協(xié)同提高血清ALT活性和肝臟MDA含量，協(xié)同降低肝臟SOD活性，加劇小鼠肝臟細(xì)胞損傷和氧化損傷;AFB1與DON還能協(xié)同提高caspase-3和P53的表達(dá)來促進(jìn)肝臟細(xì)胞凋亡。ZEA和DON不僅能協(xié)同提高血清中雌二醇含量，還能協(xié)同提

10、高caspase-3基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與單一處理相比，兩兩聯(lián)合使小鼠肝臟HSP70蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，表明聯(lián)合作用使小鼠應(yīng)激加劇。兩兩聯(lián)合（AFB1、ZEA和DON）影響小鼠脾臟促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α在mRNA水平的表達(dá)，進(jìn)而可能影響機(jī)體的免疫功能。
　　通過上述試驗(yàn)結(jié)果可得出以下結(jié)論:
　　(1)四種霉菌毒素對豬腎細(xì)胞和大鼠肝細(xì)胞的毒性趨勢一致，大小依次為:DON＞AFB1＞ZEA＞FB1。