γ-氨基丁酸對小鼠早期胚胎植入的毒性作用及機制研究.pdf

1、哺乳動物受精后，受精卵經(jīng)歷一系列分裂和形態(tài)發(fā)生形成囊胚，參與母體子宮內(nèi)膜的信息交流以啟動胚胎植入。成功的胚胎植入取決于兩個關(guān)鍵因素：即具有著床能力的囊胚和子宮內(nèi)膜容受性同步進行，任何影響囊胚形成以及子宮內(nèi)膜容受性的因素均能影響胚胎植入。
　　γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與相應(yīng)受體特異性結(jié)合發(fā)揮生理功能，如降血壓，抗焦慮，改善睡眠和提高記憶力等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在外

2、周組織，如肝臟、胰腺、子宮、卵巢和胎盤等也有GABA存在，參與細胞間的信號傳遞及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)。在生殖系統(tǒng)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)GABA在輸卵管組織中的濃度高達4438nmol/g，約是大腦含量的2倍，此外，課題組前期的研究表明GABA在小鼠妊娠D1-D4子宮中呈動態(tài)表達，并且參與小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化和胎盤形成，提示GABA在小鼠妊娠過程中可能扮演關(guān)鍵作用。目前，GABA作為一種新的食品添加劑，廣泛用于各種食品和保健品中，但不同產(chǎn)品GABA的推薦劑量

3、差別很大，從幾百毫克至幾克不等。然而，目前尚無有關(guān)GABA生殖毒性的研究。
　　本研究以妊娠小鼠為模型，首先給予妊娠小鼠不同劑量的GABA處理，探究GABA對小鼠子宮內(nèi)膜容受性的毒性影響；隨后在早期胚胎培養(yǎng)液中添加不同濃度的GABA干預(yù)，探究GABA對植入前胚胎發(fā)育的影響，從而闡明GABA對小鼠早期胚胎植入的毒性影響及其可能的作用機制。
　　第一部分、γ-氨基丁酸對妊娠小鼠子宮內(nèi)膜容受性的毒性作用
　　目的：探討 GA

4、BA對小鼠子宮內(nèi)膜容受性的毒性作用。
　　方法：
　　1.妊娠D1小鼠被隨機分為4組（每組15只），在妊娠D1-D5，分別給予6.4、10.0、12.5mg/g GABA灌胃處理，對照組則給予相同體積的生理鹽水處理。妊娠D5，尾靜脈注射0.03%臺盼藍溶液，觀察各處理組胚胎植入位點數(shù)的變化；
　　2.收集各處理組妊娠D4小鼠子宮組織，制作石蠟切片(5μm），HE染色觀察小鼠子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；
　　3.Weste

5、rn blot和qPCR妊娠D4小鼠子宮內(nèi)膜容受性標志因子E-cadherin，HOXA10和LIF的mRNA和蛋白表達水平，并通過ELISA測定子宮中IL-6的水平；
　　4.放射免疫分析法測定小鼠血清中雌二醇（E2）和孕酮（P4）的含量。
　　結(jié)果：
　　1.12.5mg/g GABA處理組小鼠胚胎植入位點數(shù)較對照組顯著降低（10.5±3.5 vs.13±2.2,P＜0.05）；
　　2.HE染色結(jié)果顯示，和

6、對照組相比，12.5mg/g GABA處理后小鼠子宮結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，子宮內(nèi)腺體數(shù)顯著減少（P＜0.05）；
　　3.與對照組比較，12.5mg/g GABA處理組小鼠子宮內(nèi)膜容受性標志因子E-cadherin，LIF，HOXA10的mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào)（P＜0.05），同時各GABA處理組小鼠子宮組織中IL-6的含量均顯著低于對照組（P＜0.01）；
　　4.12.5mg/g GABA處理組血清雌二醇（E2）和孕酮（P

7、4）的水平較對照組也顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：高濃度GABA（12.5 mg/g）能夠損害妊娠小鼠子宮內(nèi)膜容受性。
　　第二部分、γ-氨基丁酸對小鼠植入前期胚胎發(fā)育的毒性作用及機制
　　目的：探究GABA對小鼠植入前胚胎發(fā)育的毒性作用及其可能的機制。
　　方法：
　　1.收集各發(fā)育階段的小鼠植入前胚胎，通過激光共聚焦檢測GABA及其B受體B1亞基（GB1）、A受體pi亞基（GABRP）以及GAB

8、A合成酶（GAD67）的表達；
　　2.不同發(fā)育階段的胚胎分別培養(yǎng)在含10、20、30、40、50μg/μl GABA的培養(yǎng)液中，48-72h時觀察囊胚的形成并計算囊胚形成率；
　　3.給予40μM B型受體抑制劑（2-hydroxysaclofen）預(yù)處理2細胞胚胎1-2h，再分別給予30和40μg/μl GABA處理，72h時觀察囊胚的形成情況。
　　結(jié)果：
　　1. GABA與其受體GB1蛋白在小鼠植入前胚

9、胎中的表達模式一致，在2細胞和4-細胞階段，主要定位在細胞膜上，而在8-細胞至囊胚階段，則定位到細胞核中；而另一受體GABRP在植入前胚胎的各個階段均不表達。
　　2.各發(fā)育階段胚胎的囊胚形成率均隨著GABA濃度的增加而下降，且呈劑量依賴性；10μg/μl GABA可顯著降低2-細胞胚胎的囊胚形成率（92%vs.99%，P=0.017）。
　　3.40μM2-hydroxysaclofen能夠有效逆轉(zhuǎn)30μg/μl和40μg