寄生曲霉菌在不同飼料原料中產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的差異性及其機(jī)制研究.pdf

1、黃曲霉毒素（Afltoxin，AFT）是一類主要由寄生曲霉菌和黃曲霉菌產(chǎn)生的具有致癌、致畸和致突變的次級代謝產(chǎn)物，在黃曲霉毒素所有類型中，以黃曲霉毒素B1(AFB1)毒性最強(qiáng)，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織劃定為Ⅰ類致癌物。自然條件下，不同飼料原料中黃曲霉毒素的污染水平存在較大差異，探明不同原料黃曲霉毒素污染水平差異性的原因及可能的作用機(jī)制，對原料的選擇、貯藏，預(yù)防及有效控制原料中黃曲霉毒素的污染，從而保證飼料產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要理論依據(jù)和指導(dǎo)意義

2、。因此，本項(xiàng)目在研究籽粒完整性對寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1影響的基礎(chǔ)上，分析影響不同原料AFB1污染水平差異的可能成分，研究這些成分對寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1的影響，闡明不同飼料原料黃曲霉毒素污染水平差異性的原因及可能的作用機(jī)制。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.籽粒完整性對寄生曲霉菌產(chǎn)生黃曲毒毒素B1的影響研究
　　試驗(yàn)選取飼料工業(yè)生產(chǎn)中的常規(guī)飼料原料（玉米、小麥、花生和大豆）及其副產(chǎn)品（玉米粕、小麥粕、花生粕和大豆粕）作為試驗(yàn)

3、材料，接種寄生曲霉菌孢子液，在同等條件下培養(yǎng)15d，分別在0d，5d，10d和15d收集樣品，通過高效液相色譜儀測定樣品中AFB1的含量。結(jié)果表明:
　　1)未滅菌、滅菌處理的粉碎玉米、花生、大豆和小麥及其副產(chǎn)品均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，刺激寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1的量增加。同時(shí)期未滅菌、滅菌粉碎樣品，AFB1產(chǎn)生量均顯著高于其對應(yīng)餅粕類樣品(P＜0.05）。同時(shí)期滅菌粉碎的不同原料及其副產(chǎn)品AFB1含量均高于對應(yīng)的未滅菌同類樣品。

4、r>　　2)玉米、小麥、花生和大豆籽粒樣品隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，除表面滅菌處理和高壓滅菌處理的籽粒玉米在培養(yǎng)5d時(shí)AFB1含量最高外，其它籽粒樣品（花生、大豆和小麥）產(chǎn)生AFB1的最高含量均出現(xiàn)在培養(yǎng)15d。寄生曲霉菌在玉米、小麥、花生和大豆籽粒上開始生長的部位不同。同等條件下，觀察到寄生曲霉菌最先在籽粒玉米和小麥胚部開始生長，但在籽?；ㄉ陀衩字械纳L速度比在大豆和小麥中生長快速。說明籽粒結(jié)構(gòu)及其完整性不同對寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1的影響

5、也不同，這可能是影響寄生曲霉菌在玉米、小麥、花生和大豆中AFB1產(chǎn)生的重要因素。
　　2.油脂種類及其水平對寄生曲霉菌在不同原料中產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的影響研究
　　試驗(yàn)以脫脂原料（脫脂玉米粉、脫脂大豆粉、脫脂小麥粉、脫脂花生粉、脫脂玉米胚粉和脫脂小麥胚粉）為試驗(yàn)材料，添加不同油脂（玉米油、花生油、大豆油和小麥油）的不同水平（2％，5％，10％和15％），接種寄生曲霉菌的孢子液，在同等條件下培養(yǎng)15d，分別在0d，5d，10d

6、和15d收集樣品，通過高效液相色譜儀測定樣品中AFB1的含量。結(jié)果表明:
　　1)不同油脂及其添加水平對寄生曲霉菌在對應(yīng)脫脂原料中產(chǎn)生AFB1的影響。結(jié)果顯示，所用的6種脫脂樣品在培養(yǎng)前10d均隨著培養(yǎng)時(shí)間和對應(yīng)油脂添加水平的增加，AFB1含量線性增加，除脫脂玉米粉、脫脂大豆粉、脫脂小麥粉、脫脂小麥胚粉的15％油脂添加水平和脫脂小麥粉的2％、10％油脂添加水平AFB1積累程度在培養(yǎng)10d時(shí)最高，其余樣品AFB1含量均在培養(yǎng)15d時(shí)

7、最高。說明脂肪含量是影響寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1的重要因素，但不同油脂的同一個(gè)添加水平在對應(yīng)的原料中產(chǎn)生AFB1的量和積累速度不同。
　　2)不同油脂及其添加水平對寄生曲霉菌在不同脫脂原料中產(chǎn)生AFB1的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同油脂的同一添加水平對寄生曲霉菌在同一脫脂原料中產(chǎn)生AFB1的差異相對較小，而同一油脂同一添加水平對寄生曲霉菌在不同脫脂原料中產(chǎn)生AFB1的差異較大。在培養(yǎng)10d時(shí)，當(dāng)四種油脂（大豆油、花生油、玉米油和小麥油）

8、的15％油脂水平添加到脫脂大豆粉中，AFB1含量最大值是最小值的1.4倍。而當(dāng)大豆油的15％油脂水平添加到不同脫脂樣品（脫脂大豆粉、脫脂花生粉、脫脂玉米胚粉、脫脂小麥胚粉、脫脂玉米粉和脫脂小麥粉）中，AFB1含量最大值是最小值的31.3倍。其他油脂的不同油脂水平均出現(xiàn)類似趨勢。而且在培養(yǎng)15d時(shí)，所有油脂種類及其油脂水平刺激寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1的量與培養(yǎng)10d時(shí)產(chǎn)生AFB1的量均出現(xiàn)類似趨勢。說明脂肪含量是影響寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1的

9、重要因素，但是脂肪種類對AFB1產(chǎn)生的影響較小。
　　3.不同營養(yǎng)成分對寄生曲霉菌在合成培養(yǎng)基中產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的影響及其可能的作用機(jī)制研究
　　通過準(zhǔn)確分析試驗(yàn)樣品的不同營養(yǎng)成分（氨基酸、礦物質(zhì)、碳和氮含量），選擇可能影響黃曲霉毒素產(chǎn)生的成分和水平，以合成培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質(zhì)，接種寄生曲霉菌的孢子液，在同等條件下培養(yǎng)3d后收集樣品。通過高效液相色譜儀測定培養(yǎng)液中的AFB1含量，Real-time PCR技術(shù)測定黃曲霉毒素生物

10、合成過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)量。結(jié)果表明:
　　1)不同試驗(yàn)樣品中各氨基酸（蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸）含量差異在幾倍至幾十倍。樣品中礦物質(zhì)（鉀、鈉、鎂、鈣、鐵、銅、鋅和錳）含量，除鈣、鈉含量差別較小外，其余礦物質(zhì)含量差別較大，變化幅度在5-30倍。不同樣品中碳含量差別較小，其最低碳含量和最高碳含量之間差別不足1.5倍。樣品之間的氮含量差別較大，在10倍左右。
　　2)天冬氨酸、苯丙氨酸、

11、亮氨酸、谷氨酸對寄生曲霉菌在合成培養(yǎng)基中刺激AFB1產(chǎn)生最明顯，最佳添加水平分別是:1％，2％，4％和1％。甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸和賴氨酸隨著添加量的增加對AFB1產(chǎn)生的影響較小。鐵、銅、錳和鋅對寄生曲霉菌在合成培養(yǎng)基中刺激AFB1產(chǎn)生的最佳添加水平分別是:30mg/L，24mg/L，30mg/L和10mg/L。鎂和鉀的添加水平在0.4％和0.1％時(shí)，最有利于AFB1產(chǎn)生。碳、氮含量及碳氮比分別在45％，4％，8∶1時(shí)刺激AFB1產(chǎn)生效

12、果最明顯。說明適宜水平的營養(yǎng)成分含量能刺激寄生曲霉菌在合成培養(yǎng)基中產(chǎn)生AFB1。
　　3)與對照組相比，天冬氨酸添加水平在1％時(shí)能顯著上調(diào)aflR、aflO、aflD和aflU基因的表達(dá)(P＜0.05)。苯丙氨酸和亮氨酸添加水平分別在2％和0.5％時(shí)能顯著上調(diào)aflR、aflD、aflU、aflS和aflO基因的表達(dá)(P＜0.05)。谷氨酸添加水平在1％能顯著上調(diào)aflD、aflR、aflS和aflO基因的表達(dá)(P＜0.05)。賴

13、氨酸均有上調(diào)aflR、aflD、aflU、aflS和aflO基因表達(dá)的趨勢但是與對照組相比差異不顯著。鐵的添加量在30mg/L時(shí)顯著上調(diào)aflD、aflO和aflS基因的表達(dá)(P＜0.05)。銅的添加量在24mg/L時(shí)顯著上調(diào)aflR、aflD、aflS和aflO基因的表達(dá)(P＜0.05)。鋅的添加水平在10mg/kg時(shí)顯著上調(diào)aflR、aflU基因的表達(dá)(P＜0.05)。錳的添加水平在30mg/kg顯著上調(diào)aflR、aflD、aflU

14、和aflS基因的表達(dá)(P＜0.05)。鉀的添加量在0.1％時(shí)和鎂的添加量在0.4％時(shí)分別顯著顯著上調(diào)aflR、aflS和aflU基因的表達(dá)(P＜0.05)和aflR、aflD、aflU、aflS和aflO基因的表達(dá)(P＜0.05)。碳含量45％時(shí)，aflR、aflD、aflU和aflS基因的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。氮含量4％時(shí)，與對照組相比能顯著上調(diào)aflU、aflS和aflO基因的表達(dá)（P＜0.05）。說明苯丙氨酸、谷氨酸、亮氨

15、酸、天冬氨酸、鐵、銅、錳和鎂刺激寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1的最適添加水平，也能不同程度的上調(diào)黃曲霉毒素生物合成過程中aflR、aflS、aflO、aflU和aflD關(guān)鍵基因的相對表達(dá)。
　　綜合上述，本研究得出以下結(jié)論:1）籽粒結(jié)構(gòu)及其完整性是造成寄生曲霉菌在玉米、大豆、小麥和花生中產(chǎn)生AFB1差異的重要因素。2）脂肪含量是影響寄生曲霉菌產(chǎn)生AFB1的重要因素，但是脂肪種類對AFB1的產(chǎn)生影響較小。3）苯丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、天冬氨