基于莢膜及外毒素的免疫策略防治金黃色葡萄球菌感染效果研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（簡(jiǎn)稱金葡菌）是一種重要的人畜共患病病原菌,莢膜和外毒素是其重要的致病因子,本研究以這兩類抗原為靶點(diǎn)尋找有效的免疫學(xué)手段以替代抗生素防治感染性疾病。針對(duì)奶牛乳房炎,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),特異性卵黃抗體(IgY)具有顯著的治療作用,但是針對(duì)莢膜及外毒素的IgY尚未研究。針對(duì)人類金黃色葡萄球菌感染,目前尚無有效的疫苗。而糖工程是生產(chǎn)多糖-蛋白生物結(jié)合疫苗的全新技術(shù),通過這一手段可將金黃色葡萄球菌莢膜多糖和外毒素交聯(lián)制成多價(jià)疫苗

2、,并最大程度保護(hù)其抗原決定簇。本研究考察了莢膜-毒素生物結(jié)合疫苗在人類重要感染疾病模型中的預(yù)防作用。
　　(1)針對(duì)奶牛乳房炎,本研究采用5型(CP5)、8型(CP8)和336型（無莢膜）金黃色葡萄球菌全菌疫苗免疫蛋雞后分離純化獲得IgY(IgY-T5,IgY-T8,IgY-T336),純度達(dá)到80％。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,IgY-T5、IgY-T8及IgY-T336特異性地結(jié)合相應(yīng)血清型的抗原,三者間無交叉反應(yīng),而且都不與酸奶

3、發(fā)酵所用保加利亞桿菌結(jié)合,故對(duì)酸奶生產(chǎn)無不良影響。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明,在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)8h期間,15 mg/ml的IgY-T5和IgY-T8不能抑制T5和T8莢膜金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng),而15 mg/ml的IgY-T336可顯著抑制(4～8 h) T5、T8和T336菌的生長(zhǎng),抑制強(qiáng)度約為2個(gè)Log單位,提示抑菌作用主要依賴于IgY與表面蛋白而非莢膜的結(jié)合。細(xì)菌侵襲實(shí)驗(yàn)表明,5 mg/ml的IgY-T5,IgY-T8,IgY-T336能夠

4、分別抑制5,8和336型金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)的侵襲。以上結(jié)果表明,針對(duì)莢膜的特異性卵黃抗體在奶牛乳房炎的防治中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　(2)金黃色葡萄球菌外毒素也是奶牛乳房炎的一個(gè)主要致病因子,本研究分離金黃色葡萄球菌V8及RN6390的總外毒素,通過免疫蛋雞獲得特異性抗體(IgY-toxins)。乳酸脫氫酶(LDH)釋放實(shí)驗(yàn)表明,IgY-toxins可有效阻斷金黃色葡萄球菌外毒素對(duì)MAC-T細(xì)胞及嗜中性

5、粒細(xì)胞的裂解,此保護(hù)作用呈現(xiàn)濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)中用表達(dá)GFP的336型金黃色葡萄球菌菌株RN6390來評(píng)價(jià)IgY對(duì)金黃色葡萄球菌入侵MAC-T細(xì)胞的阻斷作用。通過熒光顯微鏡觀察,5 mg/ml的IgY-T336可明顯阻斷RN6390對(duì)MAC-T細(xì)胞的侵襲,5 mg/ml的IgY-T336和0.5 mg/ml的IgY-toxins聯(lián)合使用時(shí)能夠更好地阻斷金黃色葡萄球菌侵襲MAC-T細(xì)胞,而且細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)大大改善。臨床型乳房炎實(shí)驗(yàn)表明,三種

6、莢膜特異性IgY聯(lián)合治療（IgY-T5,IgY-T8及IgY-T336各20 mg）5天后,患病奶牛乳液中體細(xì)胞計(jì)數(shù)(SCC)明顯降低,使用20 mg的IgY-toxins可達(dá)到同等效果。如果將三種莢膜特異性IgY（每種20 mg）和IgY-toxins(20 mg)聯(lián)合使用兩天后,體細(xì)胞數(shù)就得到顯著降低,SCC數(shù)降至1～2×104 cells/ml,并一直保持到實(shí)驗(yàn)的第6天,且最終SCC水平低于抗莢膜或者毒素IgY單獨(dú)治療組,療效與青

7、霉素(100 mg)治療組相當(dāng)。通過感觀評(píng)價(jià)治療后第6天奶樣發(fā)現(xiàn),所有4個(gè)治療組奶樣凝塊水平都明顯低于對(duì)照組,組間無差異。3個(gè)IgY治療組不能顯著降低奶樣中金黃色葡萄球菌數(shù)。結(jié)合(1),以上結(jié)果提示抗莢膜和毒素特異性IgY聯(lián)合使用比單獨(dú)使用更有效,IgY在乳房炎的治療中應(yīng)該著眼于中和毒素和抵御金黃色葡萄球菌入侵上皮細(xì)胞,而非抑菌作用。
　　(3)針對(duì)人類的感染疾病,體外功能性實(shí)驗(yàn)表明,莢膜多糖-毒素生物結(jié)合疫苗免疫所得抗體α CP

8、5-Epa、αCP5-Hla、αCP8-Epa能特異性地調(diào)理5型和8型金黃色葡萄球菌被嗜中性粒細(xì)胞殺傷,αCP5-Hla還可有效中和α-毒素的細(xì)胞毒作用。提示,糖工程技術(shù)可在大腸桿菌中成功表達(dá)具有免疫原性和生物學(xué)功能的金黃色葡萄球菌結(jié)合疫苗。
　　(4)金黃色葡萄球菌菌血癥是臨床上很常見的感染,本研究通過小鼠菌血癥模型研究發(fā)現(xiàn),主動(dòng)免疫0.2μg CP5-2μg Epa可有效預(yù)防小鼠菌血癥及體重下降、腎臟膿腫。被動(dòng)免疫1 mg的α

9、CP5-Epa可有效預(yù)防Reynolds、USA100及USA200所致的小鼠菌血癥。主動(dòng)免疫2μg CP5-20μg Hla或被動(dòng)免疫1 mg的αCP5-Hla有效預(yù)防小鼠菌血癥。對(duì)于CP8菌株,主動(dòng)免疫0.2μg CP8-2μg Epa可預(yù)防Reynolds(CP8+)所致菌血癥,但是對(duì)體重下降、腎臟膿腫沒有顯著的保護(hù)作用。被動(dòng)免疫1 mg的α CP8-Epa可顯著預(yù)防Reynolds(CP8+)引起的小鼠菌血癥。提示CP5和CP8

10、疫苗對(duì)系統(tǒng)性感染-菌血癥的預(yù)防切實(shí)有效。
　　(5)金黃色葡萄球菌肺炎也是臨床上非常嚴(yán)重的感染,致死率很高。本研究通過小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),主動(dòng)免疫2μg CP5-20μg Hla可有效預(yù)防由Newman(CP5+)以及兩株MRSA菌株LAC(CP-)和ST80(CP8+)所引起的致死性肺炎,同時(shí)可有效預(yù)防Reynolds(CP5+)所致小鼠菌血癥。小鼠免疫CP5-Hla后,利用單克隆抗體將CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞剔除,其存活率

11、與不剔除時(shí)無顯著差異。提示,T細(xì)胞在CP5-Hla主動(dòng)免疫保護(hù)過程中不起作用。被動(dòng)免疫1 mgαCP5-Hla可有效預(yù)防小鼠的菌血癥,而且能夠顯著延長(zhǎng)小鼠在致死性肺炎模型中的存活時(shí)間,但是不能提高存活率。分別在攻毒前24h和2h被動(dòng)免疫1 mg的αCP5-Hla可顯著預(yù)防小鼠死于致死性肺炎。
　　(6)金黃色葡萄球菌也能在醫(yī)療器械,如導(dǎo)管上定殖,甚至形成生物被膜,從而導(dǎo)致感染。在導(dǎo)管介導(dǎo)的大鼠心內(nèi)膜炎模型中,αCP5-Hla不能起

12、到穩(wěn)定的保護(hù)作用,對(duì)模型相關(guān)的心臟瓣膜贅生物的形成、菌血癥水平、體重指數(shù)、腎臟細(xì)菌水平及存活率只是呈現(xiàn)一定的保護(hù)趨勢(shì)?？贵w劑量需要進(jìn)一步摸索。
　　以上結(jié)果表明,金黃色葡萄球菌莢膜多糖和外毒素是免疫防治策略很好的靶點(diǎn)。因此,針對(duì)這兩個(gè)靶點(diǎn)的IgY可有效治療臨床型金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎。利用糖工程方法生產(chǎn)的莢膜-毒素生物結(jié)合疫苗可有效預(yù)防小鼠菌血癥（系統(tǒng)性感染）、肺炎（局部性感染）,而且對(duì)心內(nèi)膜炎（外科介入相關(guān)感染）有一定的保護(hù)趨