絲狀支原體PG3株和綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙分離株基因組測(cè)序及可變表面脂蛋白基因克隆表達(dá).pdf

1、羊支原體性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPSG)是由絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae，Movi)和在我國(guó)還未發(fā)現(xiàn)的山羊支原體山羊亞種(Mycoplasma capricolum subsp.capricolu,Mcc)引起的羊的高度接觸性傳染病。以高熱

2、、咳嗽、喘氣、漸進(jìn)性消瘦，肺間質(zhì)增生性炎癥、胸和胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎癥為主要病變特征。本病自首次報(bào)道以來(lái)，在畜牧業(yè)以羊養(yǎng)殖業(yè)為主的不發(fā)達(dá)國(guó)家廣泛流行，給各國(guó)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于藥物治療的效果不盡人如意，傳統(tǒng)疫苗本身具有難以克服的局限，所以人們開(kāi)始致力于新型藥物和疫苗的研制。目前幾乎沒(méi)有保護(hù)性抗原基因的篩選及其詳細(xì)的研究報(bào)道，因此為了尋找編碼保護(hù)性抗原基因，本研究在對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)病料樣品進(jìn)行病原分離、培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)病原體

3、基因組進(jìn)行了測(cè)序及生物信息學(xué)分析。通過(guò)基因工程方法，重組表達(dá)了絲狀支原體山羊亞種PG3株的可變膜表面脂蛋白，制備重組亞單位疫苗，并進(jìn)行了免疫保護(hù)效果的初步探討，得到以下結(jié)果:
　　 1.從內(nèi)蒙古包頭、烏蘭察布市和鄂爾多斯市采集了疑似患羊傳染性胸膜肺炎的羊只的肺臟、氣管、肝臟、胸水和心包積液共67份樣品。從烏蘭察布市和鄂爾多斯市采集的肺臟、氣管和心包積液樣品中分離到18株支原體。通過(guò)菌落形態(tài)特征觀察、生理生化試驗(yàn)鑒定、16S rR

4、NA基因PCR擴(kuò)增和16S rRNA基因序列同源性分析以及生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)多項(xiàng)分類(lèi)和鑒定方法證實(shí)了分離菌株EF1、EF2、EQ1、EQ2、EF26、EQ22、WF1、WF2和WXB1為綿羊肺炎支原體，其中EF2、EQ2、WF1、WF2和WXB1分離自綿羊病例，EF1、EQ1、EF26和EQ22分離自山羊病例;分離菌株EF9、EQ9、EF12、EF13、EF19、和EF21為精氨酸支原體;分離菌株EF22為絲狀支原體山羊亞種;分離菌株EF4為

5、解脲支原體。由此確定了內(nèi)蒙古地區(qū)流行的羊支原體肺炎的主要致病菌型是綿羊肺炎支原體。
　　 2.本研究采用高通量Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)絲狀支原體山羊亞種PG3株和綿羊肺炎支原體分離株WXB1的全基因組進(jìn)行了測(cè)序與拼接，借助軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)全基因組序列所承載的遺傳信息進(jìn)行了注釋和分析。絲狀支原體山羊亞種PG3株基因組大小為1，025，065bp，GC％為23.61％，含有3個(gè)rRNA，28個(gè)tRNA，12個(gè)sRNA，預(yù)測(cè)含有846

6、個(gè)編碼基因，在基因組上未檢測(cè)到GI，該菌株不存在IS或者ICE序列。該菌株具有絲狀支原體山羊亞種特有的麥芽糊精/麥芽糖代謝途徑。綿羊肺炎支原體分離株WXB1基因組大小為1，084，159bp，GC％為29.14％，含有3個(gè)rRNA，30個(gè)tRNA，11個(gè)sRNA，預(yù)測(cè)含有888個(gè)編碼基因。根據(jù)COG分類(lèi)和KEGG代謝通路分類(lèi)，兩個(gè)基因組中絕大多數(shù)基因主要與蛋白翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與合成、DNA復(fù)制與修復(fù)、糖代謝和環(huán)境信號(hào)傳遞與轉(zhuǎn)換這幾個(gè)方面

7、有關(guān)。
　　 3.人們認(rèn)為支原體在感染的不同階段通過(guò)表面可變蛋白加強(qiáng)定殖和適應(yīng)宿主的組織環(huán)境。可變表面脂蛋白對(duì)于支原體的抗原性、免疫調(diào)節(jié)和底物結(jié)合等有著重要的意義。在絲狀支原體山羊亞種PG3株基因組中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)串聯(lián)排列的可變表面脂蛋白基因，即GL000459、GL000461和GL000462。采用PCR方法對(duì)這三個(gè)可變表面脂蛋白的編碼成熟肽的基因區(qū)域進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，成功構(gòu)建了E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+

8、)-MmcGL000459、E.coli BL21(DE3)/pET-32a(+)-MmcGL000461和E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+)-MmcGL000462原核表達(dá)系統(tǒng)。SDS-PAGE和Western-blot結(jié)果證明該原核表達(dá)系統(tǒng)正確表達(dá)了分子量分別為31kDa、40kDa、41kDa的重組蛋白。同時(shí)，Western-blot分析表明這三個(gè)重組蛋白具有免疫反應(yīng)性。
　　 4.以重組蛋白制作的疫苗對(duì)

9、小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn)。通過(guò)ELISA方法測(cè)定三次免疫后小鼠的血清中特異性抗體的滴度。結(jié)果表明:經(jīng)三次免疫后小鼠血清中均產(chǎn)生了抗體，重組蛋白免疫組與對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.05)。通過(guò)調(diào)理吞噬試驗(yàn)、生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)評(píng)價(jià)融合蛋白體液免疫效果。結(jié)果表明:重組蛋白免疫小鼠的全血?dú)⒕芰εc對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.05)，生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)的結(jié)果為弱陽(yáng)性。通過(guò)Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子水平檢測(cè)和T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞免疫的檢測(cè)。Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子

10、水平檢測(cè)結(jié)果表明:重組蛋白免疫組細(xì)胞因子含量與對(duì)照組相比均升高。重組蛋白His-tag-GL000459顯著提高IL-2和IL-4的產(chǎn)生(p＜0.05)，而IL-10和IFN-γ的含量稍有提高(p＞0.05);His-tag-GL000461能顯著提高IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ4種細(xì)胞因子的產(chǎn)生(p＜0.05);His-tag-GL000462能顯著提高IL-2、IL-4和IFN-γ3種細(xì)胞因子的產(chǎn)生(p＜0.05);而