豬肺炎支原體MY-99株P(guān)46基因的克隆測(cè)序及原核表達(dá).pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneuminiae，Mhp)是豬支原體肺炎的病原體。P46基因是編碼豬肺炎支原體膜蛋白P46的基因片段，P46膜蛋白被認(rèn)為是Mhp的特異性表面蛋白。 本研究根據(jù)已報(bào)道的序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)帶有BAMHⅠ和HINDⅢ酶切位點(diǎn)的引物，利用PCR從Mhp野毒株MY-99擴(kuò)增出了P46基因，經(jīng)克隆測(cè)序，該基因序列全長(zhǎng)1134bp，編碼378個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)其表達(dá)的蛋白分子量為41.49KDa，PI值為

2、5.97。該基因序列中含有3個(gè)TGA編碼Trp，將MY-99株的P46基因與Mhp國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株232株、J株和7446株比較其的同源性達(dá)到99％，且其編碼氨基酸的同源性也達(dá)99％以上。 P46基因經(jīng)過克隆，通過設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行定點(diǎn)突變，利用引物分別針對(duì)3個(gè)位點(diǎn)的TGA進(jìn)行修飾，通過測(cè)序驗(yàn)證，我們成功地對(duì)MY-99株的基因進(jìn)行了改造,將182、381和734位的A突變G，并將T載體內(nèi)的P46基因亞克隆嵌入表達(dá)載體pet-32a(+)，

3、構(gòu)建了pet-32a(+)-P46重組質(zhì)粒。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)菌rosetta，得到重組表達(dá)菌Ro-CTB600。在IPTG的誘導(dǎo)下，P46蛋白在重組表達(dá)菌中獲得了融合表達(dá)，得到了融合蛋白Trx-P46。通過SDS-PAGE分離純化表達(dá)的融合蛋白Trx-P46產(chǎn)物檢測(cè)證實(shí)，重組表達(dá)的Mhp-MY-99株的P46為融合蛋白，其大小與預(yù)測(cè)的分子量相同為61.79KDa(其重組質(zhì)粒中由TrxA及其它附加序列編碼蛋白的分子量約為20