絲狀支原體山羊亞種PG3株LppA基因的原核表達(dá)及免疫學(xué)特性研究.pdf

1、山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious Caprine Pleuropneumonia，CCPP)被世界動物衛(wèi)生組織列為B類傳染病，為山羊特有的急性或慢性高度接觸性傳染病。
　　本論文將絲狀支原體山羊亞種PG3株復(fù)活后大量培養(yǎng)，獲得其基因組。并以其為模板，用一對特異性引物(上游引物3’端和下游引物5’端引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn))擴(kuò)增LppA基因。由于LppA基因中含有一個密碼子TGA在支原體中編碼色氨酸而在原核表達(dá)系統(tǒng)

2、中作為終止密碼子，因此又設(shè)計出一對突變引物將TGA同義突變成TGG后構(gòu)建克隆質(zhì)粒，將含目的片段的克隆質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET-32a(+)經(jīng)雙酶切后構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒PET-32a-LppA，將PET-32a-LppA轉(zhuǎn)入宿主菌后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE電泳分析，證明所表達(dá)的融合蛋白的蛋白分子量大小為64kDa，Western-blot分析表明，該蛋白具有免疫反應(yīng)性；將融合蛋白純化后對小鼠分別進(jìn)行三次免疫，采血收集各個免

3、疫階段的血清。應(yīng)用 ELISA方法測定小鼠血清中是否產(chǎn)生相應(yīng)的LppA抗體。結(jié)果表明：經(jīng)三次免疫后小鼠血清中均產(chǎn)生了相應(yīng)的LppA抗體，其中融合蛋白免疫組與空白對照組相比差異極顯著(P＜0.01)；通過吞噬調(diào)理試驗(yàn)檢測融合蛋白是否能增強(qiáng)吞噬調(diào)理作用，試驗(yàn)結(jié)果表明：融合蛋白全血的殺菌能力與空白對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。
　　以上結(jié)果說明，本研究成功地突變、克隆并表達(dá)了絲狀支原體山羊亞種PG3株的LppA基因，并成功的構(gòu)建