玉米R(shí)ubisco活化酶基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，簡(jiǎn)寫(xiě)Rubisco)是葉片中含量最豐富的可溶性蛋白，其通過(guò)影響光合碳同化和光呼吸過(guò)程對(duì)光合作用產(chǎn)生明顯影響。但是該酶在植物體內(nèi)的催化效率很低，只有在Rubisco活化酶(RCA)存在時(shí)，才能保持較高的催化活性。RCA是一種核編碼葉綠體蛋白，廣泛存在于光合生物中，具有活化Rubisco的功能。RCA在調(diào)節(jié)植

2、物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，自在擬南芥中被報(bào)道以來(lái)，一直是農(nóng)業(yè)生物工程研究的焦點(diǎn)。
　　本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法同源克隆玉米R(shí)CA基因;通過(guò)制備特異性抗體、Westernblot分析、MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析研究RCA基因的編碼機(jī)制;通過(guò)表達(dá)GFP融合蛋白的方法對(duì)玉米R(shí)CA進(jìn)行亞細(xì)胞定位;通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和半定量RT-PCR的方法分析RCA基因的表達(dá)模式;通過(guò)相關(guān)分析和回歸分析的方法明確RCA基因與產(chǎn)量之間

3、的關(guān)系。以上研究結(jié)果可以為玉米分子遺傳育種利用該基因提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：⑴基于玉米B73基因組序列同源克隆兩個(gè)RCA基因，其中一個(gè)為前人已報(bào)道基因Zmrca1，另一個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的基因，暫命名為Zmrca3。其中Zmrca1的開(kāi)放閱讀框(ORF)1299bp，編碼433個(gè)氨基酸，成熟蛋白包括381個(gè)氨基酸，分子量為42.70kD。新發(fā)現(xiàn)的Zmrca3基因開(kāi)放閱讀框1389bp，編碼463個(gè)氨基酸，成熟蛋白包括411個(gè)氨基酸，分子

4、量為45.96kD。⑵通過(guò)體外原核表達(dá)和葉片體內(nèi)RCA蛋白表達(dá)試驗(yàn)闡明RCA基因的編碼機(jī)制。對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物分析表明，Zmrca3和Zmrca1分別編碼兩個(gè)大小不同的蛋白，相應(yīng)重組蛋白的分子量分別為52.8kD和50.1kD。玉米葉片RCA蛋白實(shí)驗(yàn)表明，玉米葉片中存在兩個(gè)大小不同RCA亞基，其中Zmrca3基因編碼較大的多肽，Zmrca1基因編碼較小的多肽。⑶通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和半定量RT-PCR的方法分析了Zmrca1和Zmr

5、ca3的表達(dá)特性。結(jié)果表明兩個(gè)RCA基因均具有組織表達(dá)特異性和生物鐘特性，其中在葉片中表達(dá)量最高，而在根中幾乎檢測(cè)不到;夜間兩基因的表達(dá)量逐漸增加，直至上午8:30表達(dá)水平最高，隨后逐漸下降，至夜間20:30表達(dá)水平最低。此外，兩基因在玉米抽穗期之前表達(dá)水平較低，灌漿期（授粉后第16-40天）表達(dá)水平相對(duì)較高。非生物脅迫分析表明，Zmrca1和Zmrca3的表達(dá)均受30℃高溫誘導(dǎo)。⑷通過(guò)TargetP1.1和WOLF PSORT對(duì)Zmr

6、ca1和Zmrca3所編碼的蛋白進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果表明RCA兩個(gè)蛋白主要定位在葉綠體上。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)果，當(dāng)GFP單獨(dú)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體時(shí)，GFP蛋白均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中;當(dāng)構(gòu)建的兩個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體時(shí)，融合蛋白分布在葉綠體中。⑸在123份具有廣泛遺傳變異的玉米自交系中，RCA基因相對(duì)表達(dá)量與單株產(chǎn)量相關(guān)分析表明，Zmrca1和Zmrca3相對(duì)表達(dá)量與單株產(chǎn)量分別呈極顯著和顯著正相關(guān)?；貧w分析表明，Zmrca1和Zmrca3兩