蛹蟲(chóng)草和蟬花組氨酸激酶基因的表達(dá)以及蛹蟲(chóng)草組氨酸激酶蛋白檢測(cè).pdf

1、組氨酸激酶是雙組份系統(tǒng)的重要部分，而雙組份系統(tǒng)是真菌感受外界刺激的重要機(jī)制，它使真菌能適應(yīng)和應(yīng)答環(huán)境的改變。蟬花和蛹蟲(chóng)草是傳統(tǒng)的藥食兩用真菌，通過(guò)對(duì)其組氨酸激酶基因的研究，在理論上比較同為它們的組氨酸激酶基因的表達(dá)調(diào)控差異。
　　根據(jù)已知的蛹蟲(chóng)草組氨酸激酶基因（CmHK）的序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，對(duì)蟬花組氨酸激酶基因 IcHK進(jìn)行克隆，克隆獲得的序列經(jīng)過(guò)測(cè)序、比對(duì)，最終獲得了IcHK基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）序列，全長(zhǎng)為2811bp。對(duì)序

2、列進(jìn)行分析表明，IcHK基因可編碼963個(gè)氨基酸殘基，它的翻譯產(chǎn)物IcHK有4個(gè)HAMP功能域、1個(gè)HisKA功能域、1個(gè)HATPase_c功能域和1個(gè)REC功能域。
　　長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)組氨酸激酶的研究主要聚焦在它對(duì)外界信號(hào)的表達(dá)調(diào)控上，且近年來(lái)有關(guān)殺真菌劑表達(dá)調(diào)控的研究頗多。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了三種殺真菌劑（咯菌腈、異菌脲和克菌丹）對(duì)蛹蟲(chóng)草組氨酸激酶CmHK和蟬花組氨酶激酶IcHK表達(dá)的影響。結(jié)果表明，CmHK基因和I

3、cHK基因?qū)@三種殺菌劑的敏感性均有所不同：這三種殺菌劑不能導(dǎo)致CmHK基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量明顯增加，因此CmHK基因的表達(dá)對(duì)這三種殺菌劑的影響不敏感；而它們都可導(dǎo)致IcHK基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的增加，說(shuō)明IcHK基因的表達(dá)對(duì)這三種殺菌劑的影響都敏感，尤其對(duì)咯菌腈和克菌丹更為敏感。
　　針對(duì)已獲得的蛹蟲(chóng)草組氨酸激酶基因，設(shè)計(jì)兩種方法來(lái)制備抗體，一種方法是通過(guò)原核表達(dá)CmHK基因的部分序列獲得融合表達(dá)蛋白，并以此作為抗原制備抗體。依據(jù)CmH

4、K基因ORF序列及其功能域分析，將其分為兩段（CmHK1和CmHK2）分別設(shè)計(jì)引物，將PCR獲得的CmHK1和CmHK2兩個(gè)部分序列分別連接表達(dá)載體pET-41a（+），最終轉(zhuǎn)化到BL21（Escherichia coli）受體細(xì)胞，以構(gòu)建CmHK1和CmHK2的原核表達(dá)系統(tǒng)。利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，并使用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin純化表達(dá)蛋白。純化的融合蛋白CmHK1和CmHK2作為抗原免疫家兔后獲得了

5、兩種抗體anti-CmHK1和anti-CmHK2。另一種方法是化學(xué)合成CmHK抗原決定簇短肽，偶聯(lián)載體蛋白后作為抗原制備抗體?；瘜W(xué)合成三條短肽HK3、HK4和HK5后，分別與BSA偶聯(lián)作為抗原制備了三種抗體 anti-HK3、anti-HK4和 anti-HK5。將這兩種方法獲得的抗體通過(guò)Western blotting方法檢測(cè)CmHK在蛹蟲(chóng)草中的存在形式。Western blotting分析發(fā)現(xiàn)只有 anti-CmHK2沒(méi)有出現(xiàn)特異