家蠶絲氨酸蛋白酶BmHP14的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、昆蟲作為低等的節(jié)肢動物,不具備高等動物所具有的獲得性免疫系統(tǒng),它們依賴先天性免疫應(yīng)答機(jī)制來識別、應(yīng)對入侵和損傷。昆蟲免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩個部分,細(xì)胞免疫主要是基于血細(xì)胞的一些防御反應(yīng),包括吞噬、結(jié)瘤和包囊等;體液免疫主要包括抗菌肽的生成,凝集反應(yīng)和黑色素的形成。在酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)中,一系列絲氨酸蛋白酶被連續(xù)的激活,初始信號級聯(lián)放大并激活最終的蛋白酶——前酚氧化酶激活蛋白酶。被激活的前酚氧化酶激活酶激活前酚氧化酶產(chǎn)生有活性的酚

2、氧化酶,酚氧化酶能催化酚氧化產(chǎn)生聯(lián)苯醌,最終形成沉積丁二微生物和血細(xì)胞表面的黑色素。
　　 煙草天蛾(Manducasexta)酚氧化酶原激活系統(tǒng)研究的比較透徹。作為起始的免疫應(yīng)答蛋白酶,血淋巴蛋白酶M.sextaHP14在接收上游信號后可以自發(fā)激活,進(jìn)而引起下游通路中的蛋白酶激活。家蠶(Bombyxmori)的酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)研究的比較早,但是目前在家蠶中還沒有關(guān)于酚氧化酶原激活系統(tǒng)的起始蛋白酶研究的相關(guān)報道。本研究首先通過信

3、息學(xué)分析在家蠶EST數(shù)據(jù)庫中檢索獲得與煙草天蛾血淋巴蛋白酶HP14同源性的基因序列,通過基因克隆和RACE技術(shù)得到家蠶血淋巴蛋白酶HP14(BmHP14)基因的全長cDNA片段并分析了該基因的結(jié)構(gòu);通過RT-PCR技術(shù)分析了該基因的組織表達(dá)譜;用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析了該基因在受到黑胸敗血芽孢桿菌(革蘭氏陽性菌)、大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)和球孢白僵菌(真菌)侵染后的表達(dá)情況:原核表達(dá)并純化了BmHP14融合蛋白,制備了BmHP14抗

4、體;通過Westernblotting技術(shù)檢測了BmHP14在受到革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌侵染后蛋白水平的表達(dá)情況。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1、家蠶BmHP14基因的全長cDNA克隆及序列分析
　　 通過生物信息學(xué)分析,在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中篩選得到一個與煙草天蛾MsHP14基岡同源的基因組片段,在此基礎(chǔ)上結(jié)合EST數(shù)據(jù),采用分子克隆和5'RACE、3'ACE技術(shù)得到該基岡的全長cDNA序列,命名為BmHP1

5、4(GenbankNO.JQ954757)。
　　 序列分析發(fā)現(xiàn),家蠶BmHP14基因具有17個外顯子,16個內(nèi)含子。通過在線軟件分析發(fā)現(xiàn)BmHP14編碼的蛋白質(zhì)為一個理論等電點(diǎn)5.09,分子量71kDa的蛋白質(zhì)。使用SignalP3.0Server分析發(fā)峴前17個氨基酸為信號肽序列。對基因5'端序列分析發(fā)現(xiàn),上游存在著包括NF-κB、GATA等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控位點(diǎn)。
　　 通過將家蠶、煙草天蛾、黃粉蟲、果蠅的絲氨酸蛋白酶

6、基因進(jìn)行多重序列比對分析發(fā)現(xiàn),家蠶BmHP14與煙草天蛾MsHP14有高度的保守性。煙草天蛾的MsHP14在酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)中作為最先激發(fā)的絲氨酸蛋白酶對下游的信號通路起到關(guān)鍵作用,因此推測家蠶BmHP14可能作為家蠶酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)中的最先激發(fā)的絲氨酸蛋白酶。
　　 2、家蠶BmHP14基因的表達(dá)分析
　　 提取家蠶5齡3天各組織cDNA,RT-PCR檢測靶標(biāo)基因的表達(dá)情況,分析顯示BmHP14基因在脂肪體、馬氏管、精

7、巢、卵巢、表皮、血細(xì)胞和頭中有表達(dá),其中在脂肪體中表達(dá)量最高。用革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌侵染5齡3天的家蠶后,提取家蠶脂肪體組織的cDNA。用RT-PCR和熒光定量PCR檢測BmHP14基因的表達(dá)情況,分析顯示家蠶BmHP14基因在受到病原菌侵染時,誘導(dǎo)表達(dá)上升。
　　 3、家蠶BmHP14抗體的制備及檢測
　　 構(gòu)建pET28a-His-BmHP14原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中大量誘導(dǎo)表達(dá),并純化獲得重組BmHP14蛋

8、白。將重組BmHP14蛋白免疫成年新西蘭公兔,制備多克隆抗體。并用Westernblotting檢測革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌對5齡3天的家蠶侵染后血淋巴中BmHP14蛋白的分布情況。檢測結(jié)果顯示革蘭氏陽性菌侵染后,BmHP14蛋向在誘導(dǎo)3小時后表達(dá)上調(diào),6小時后表達(dá)量降低,12小時后表達(dá)量升高直到24小時表達(dá)量保持較高水平。革蘭氏陰性菌侵染家蠶后,從誘導(dǎo)1小時開始BmHP14蛋白表達(dá)上調(diào),到24小時一直保持表達(dá)較高水平。家蠶受到真菌侵