鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及耐藥性的初步研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌引起的主要侵害雛鴨、雛鵝等多種雛禽的一種接觸性、敗血性傳染病。發(fā)病鴨主要是依靠抗菌藥物進行治療，但有報道常用的抗菌藥物對鴨疫里氏桿菌的敏感性逐漸下降，但對相關(guān)的耐藥機制仍缺乏較深入的研究，本論文以2010年江蘇某鴨場分離鑒定的鴨疫里氏桿菌為研究對象，探討了其對氯霉素類抗生素、氨基甙類抗生素和利福平的耐藥性及其耐藥機制。
　　本次試驗首先從江蘇某發(fā)病鴨場共采集疑似樣品6份，對樣品進行了鴨疫里氏桿菌的檢測

2、，試驗從菌株形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性及16SrRNA檢測等方面對分離菌株進行鑒定;然后采用微量稀釋法測定了15種抗菌藥物對鴨疫里氏桿菌臨床分離菌株的體外最小抑菌濃度(MIC);同時建立了PCR方法檢測分離菌株中介導利福平、氯霉素、氨基糖苷類抗生素耐藥的主要基因，對檢測到的氯霉素cat耐藥基因通過Southern雜交的方法進行定位，并對利福平rpoB基因進行突變位點的分析，對于檢測到的氨基糖苷類耐藥基因進行測序和序列比對;最后采用體外遞增

3、藥物濃度的方法誘導出氟苯尼考耐藥的里氏桿菌，并對人工誘導耐藥菌株的敏感性、生長特性及耐藥機制進行初步了研究。
　　實驗結(jié)果顯示:病鴨分離到的細菌經(jīng)形態(tài)觀察、選擇性培養(yǎng)、生化特性測定及16SrRNA檢測，可鑒定為鴨疫里氏桿菌;本次鴨場分離的鴨疫里氏桿菌對氟苯尼考全部敏感，但對大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素、利福平、多黏菌素E、頭孢曲松鈉、四環(huán)素、氟喹諾酮類等藥物均表現(xiàn)出一定程度的耐藥;PCR檢測到的氯霉素耐藥基因主要為cat基因，應(yīng)用South

4、ern雜交方法檢測該基因主要定位于染色體基因組上。通過測序以及與Genbank中的基因?qū)Ρ?，發(fā)現(xiàn)對氨基糖苷類抗生素耐藥的菌株主要檢測到的耐藥基因為aac和aadA。對利福平耐藥的菌株主要分析了其rpoB基因，通過測序和與敏感株序列及NCBI登陸的相關(guān)序列進行對比分析，發(fā)現(xiàn)在4株利福平耐藥菌株中，均存在rpoB基因的突變，其中1株菌的rpoB在357、358位有堿基C和G的插入，360位有堿基A的插入，導致出現(xiàn)Glu-Asp和Asp-Hi

5、s氨基酸的突變;1株菌的rpoB在517位點發(fā)生堿基突變(T-C)，導致氨基酸Thr突變?yōu)镃ys;另外2株菌的383位堿基突變(G-A)，導致氨基酸由Arg突變?yōu)長ys。人工誘導的3株氟苯尼考耐藥的鴨疫里氏桿菌對氟苯尼考的MIC值均高于64mg·L-1，且發(fā)現(xiàn)誘導菌株對紅霉素的敏感性下降，部分菌株對紅霉素的MIC達到128mg·L-1;生長曲線的測定結(jié)果顯示:體外誘導的耐藥株生長速度較親本株較慢，臨床分離親本菌株的23SrRNA及核糖體

6、蛋白L4及L22基因均未發(fā)生突變，而氟苯尼考誘導的3株菌中，未檢測到相關(guān)的氟苯尼考耐藥基因，但誘導耐藥株與親本株比較，均含有23SrRNA位點突變，其中1株耐藥菌的23SrRNA出現(xiàn)了A2078G，A2304T和G2083T突變;1株耐藥菌的23SrRNA出現(xiàn)了A2058T，A2126G和A2353T位點突變;1株耐藥菌的23SrRNA出現(xiàn)了A2045T，A2577G突變，在誘導菌中出現(xiàn)的A2126G和A2353T突變未見報道;檢測的3