鴨疫里氏桿菌內(nèi)毒素的提取及黃連湯對其消除作用的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer RA)引起的嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的傳染病。該菌有21個血清型,目前針對該病沒有特效藥物,主要依靠抗生素治療,但RA易產(chǎn)生耐藥性。黃連湯是由黃連、黃柏、甘草按一定比例配伍,經(jīng)水提醇沉而制成的中藥制劑,對人工感染和自然發(fā)病的鴨群均有很高的保護率,藥物組方及制取方法已獲國家發(fā)明專利授權(quán)(ZL201010550373.8)。我們前期研究發(fā)現(xiàn),RA內(nèi)毒素(lipopoly

2、saccharide,LPS)是鴨疫里氏桿菌病的重要致病因子之一。為了研究黃連湯防治RA病的作用機制,本論文開展了鴨疫里氏桿菌LPS的提取、純化及黃連湯在體內(nèi)外對其影響的研究。
   以2型RA為實驗對象,采用熱酚水法結(jié)合乙醇純化技術(shù)提取、純化LPS,通過苯酚硫酸法、考馬斯亮藍法、瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù),對所提取內(nèi)毒素中多糖、蛋白質(zhì)、核酸進行檢測,并采用顯色基質(zhì)法測定其生物活性。結(jié)果表明,所獲得LPS與RA菌體濕重比為1.36%,

3、含糖1.48%、蛋白質(zhì)2.08%,還有部分核酸片段,其生物活性為75.6 EU/mg。相對我國內(nèi)毒素標準品原料(E.coli0111),所提取的LPS含糖和蛋白質(zhì)較低,說明本實驗所提取純化的LPS純度較高。
   將黃連、黃柏、甘草按照1∶1∶2比例配伍,采用水提醇沉和減壓蒸餾方法,獲得黃連湯有效部位藥液1.63 L,內(nèi)含以上3種藥物生藥濃度為122.7 g/L。以此藥液為母藥液,按實驗需要稀釋,配制成12.27 g/L、30.

4、9 g/L、61.35 g/L、92.03 g/L、122.7 g/L五種不同藥物濃度的供試品藥液。
   用上述五種不同濃度的藥液200μL,在體外分別作用RA(3×109 CFU/mL)、RA超聲波破碎液(3×109 CFU/mL)及提取的LPS(10 mg/mL)各11h,用顯色基質(zhì)鱟試劑法檢測各試驗組LPS的濃度變化。結(jié)果顯示,藥物作用于RA時,隨著藥物濃度的增加,LPS濃度首先由1.15EU/mg升高到2.68EU/m

5、g,然后下降到0.43EU/mg,即LPS濃度呈現(xiàn)先上升、后下降現(xiàn)象;藥物對RA超聲波破碎液和LPS作用時,隨著藥物濃度的增加,RA超聲波破碎組LPS濃度從2.49EU/mg降為0.21EU/mg,LPS組2.89EU/mg下降到0.26EU/mg,呈現(xiàn)依次下降的趨勢。這是因為:藥物直接作用于RA時,先破壞菌體結(jié)構(gòu),導(dǎo)致RA外膜的LPS大量釋放,低濃度的藥物不足以清除大量的LPS,所以LPS濃度略有升高。隨著藥物濃度的增加,大量藥物可消

6、除多余的LPS,因此表現(xiàn)為LPS濃度先升高、后下降這一現(xiàn)象;藥物對RA超聲波破碎液組及LPS組處理時,不存在細菌破裂釋放內(nèi)毒素這一環(huán)節(jié),其內(nèi)含的內(nèi)毒素量較為穩(wěn)定,所以,隨著藥物濃度的增加,LPS濃度呈現(xiàn)下降趨勢。實驗表明:黃連湯在體外對LPS具有明顯的消除作用。
   將雛鴨隨機分為5組(編號為A、B、C、D、E),其中A、B組分別用RA(0.5mL1×107CFU/mL/只)進行腹腔染毒, C、D組用LPS(10mg/只)腹腔

7、攻毒,E組為空白對照組,腹腔注射生理鹽水。B組、D組每只鴨每隔6h灌服30g/L黃連湯有效部位5mL,A、C、E組自由飲水。每隔6h測定各組鴨血漿LPS濃度。試驗表明,隨著給藥次數(shù)的增加,B、D組臨床和病理表現(xiàn)明顯減輕,如病鴨縮頸減少、開始采食,器官充血減輕、纖維素炎典型病變消失;同時,B組鴨血漿LPS濃度由56.3EU/mg降為1.7EU/mg,D組由69.3EU/mg下降到2.3EU/mg;A組和C組臨床癥狀相似,但A組較為嚴重,出

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