鴨疫里氏桿菌內(nèi)毒素的提取及黃連湯對(duì)其消除作用的研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer RA）引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的傳染病。該菌有21個(gè)血清型，目前針對(duì)該病沒(méi)有特效藥物，主要依靠抗生素治療，但RA易產(chǎn)生耐藥性。黃連湯是由黃連、黃柏、甘草按一定比例配伍，經(jīng)水提醇沉而制成的中藥制劑，對(duì)人工感染和自然發(fā)病的鴨群均有很高的保護(hù)率，藥物組方及制取方法已獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)(ZL201010550373.8)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，RA內(nèi)毒素(lipopoly

2、saccharide，LPS)是鴨疫里氏桿菌病的重要致病因子之一。為了研究黃連湯防治RA病的作用機(jī)制，本論文開(kāi)展了鴨疫里氏桿菌LPS的提取、純化及黃連湯在體內(nèi)外對(duì)其影響的研究。
　　 以2型RA為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用熱酚水法結(jié)合乙醇純化技術(shù)提取、純化LPS，通過(guò)苯酚硫酸法、考馬斯亮藍(lán)法、瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù)，對(duì)所提取內(nèi)毒素中多糖、蛋白質(zhì)、核酸進(jìn)行檢測(cè)，并采用顯色基質(zhì)法測(cè)定其生物活性。結(jié)果表明，所獲得LPS與RA菌體濕重比為1.36％，

3、含糖1.48％、蛋白質(zhì)2.08％，還有部分核酸片段，其生物活性為75.6 EU/mg。相對(duì)我國(guó)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品原料(E.coli0111)，所提取的LPS含糖和蛋白質(zhì)較低，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所提取純化的LPS純度較高。
　　 將黃連、黃柏、甘草按照1∶1∶2比例配伍，采用水提醇沉和減壓蒸餾方法，獲得黃連湯有效部位藥液1.63 L，內(nèi)含以上3種藥物生藥濃度為122.7 g/L。以此藥液為母藥液，按實(shí)驗(yàn)需要稀釋?zhuān)渲瞥?2.27 g/L、30.

4、9 g/L、61.35 g/L、92.03 g/L、122.7 g/L五種不同藥物濃度的供試品藥液。
　　 用上述五種不同濃度的藥液200μL，在體外分別作用RA(3×109 CFU/mL)、RA超聲波破碎液(3×109 CFU/mL)及提取的LPS（10 mg/mL）各11h，用顯色基質(zhì)鱟試劑法檢測(cè)各試驗(yàn)組LPS的濃度變化。結(jié)果顯示，藥物作用于RA時(shí)，隨著藥物濃度的增加，LPS濃度首先由1.15EU/mg升高到2.68EU/m

5、g，然后下降到0.43EU/mg，即LPS濃度呈現(xiàn)先上升、后下降現(xiàn)象;藥物對(duì)RA超聲波破碎液和LPS作用時(shí)，隨著藥物濃度的增加，RA超聲波破碎組LPS濃度從2.49EU/mg降為0.21EU/mg，LPS組2.89EU/mg下降到0.26EU/mg，呈現(xiàn)依次下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)?藥物直接作用于RA時(shí)，先破壞菌體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致RA外膜的LPS大量釋放，低濃度的藥物不足以清除大量的LPS，所以L(fǎng)PS濃度略有升高。隨著藥物濃度的增加，大量藥物可消

6、除多余的LPS，因此表現(xiàn)為L(zhǎng)PS濃度先升高、后下降這一現(xiàn)象;藥物對(duì)RA超聲波破碎液組及LPS組處理時(shí)，不存在細(xì)菌破裂釋放內(nèi)毒素這一環(huán)節(jié)，其內(nèi)含的內(nèi)毒素量較為穩(wěn)定，所以，隨著藥物濃度的增加，LPS濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)表明:黃連湯在體外對(duì)LPS具有明顯的消除作用。
　　 將雛鴨隨機(jī)分為5組（編號(hào)為A、B、C、D、E），其中A、B組分別用RA(0.5mL1×107CFU/mL/只)進(jìn)行腹腔染毒， C、D組用LPS（10mg/只）腹腔

7、攻毒，E組為空白對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水。B組、D組每只鴨每隔6h灌服30g/L黃連湯有效部位5mL，A、C、E組自由飲水。每隔6h測(cè)定各組鴨血漿LPS濃度。試驗(yàn)表明，隨著給藥次數(shù)的增加，B、D組臨床和病理表現(xiàn)明顯減輕，如病鴨縮頸減少、開(kāi)始采食，器官充血減輕、纖維素炎典型病變消失;同時(shí)，B組鴨血漿LPS濃度由56.3EU/mg降為1.7EU/mg，D組由69.3EU/mg下降到2.3EU/mg;A組和C組臨床癥狀相似，但A組較為嚴(yán)重，出