2009-2011年國內傳染性支氣管炎病毒分子流行病學研究及以馬立克病毒為載體的基因工程疫苗研制.pdf

1、禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬中的γ-冠狀病毒，由該病毒感染引起的疾病稱為禽傳染性支氣管炎(avian infectious bronchitis，IB)，是一種對雞危害非常嚴重的急性、高度傳染性的病毒性呼吸道疾病，可導致雞的增重和飼料報酬降低，也能引起蛋雞產蛋量和蛋的品質下降等，因此具有重要的經濟意義，免疫預防是目前控制該病的最為有效的手段。I

2、BV的重要特點之一就是血清型眾多，不同血清型之間交叉保護性較低甚至完全不能保護，因此在生產中必須選用與流行毒株血清型一致的疫苗才能取得良好的免疫保護效果。不同血清型的IBV具有典型的地域性流行特征，而且由于病毒基因組的突變和毒株間的重組使得新的血清型不斷出現(xiàn)，使免疫預防日益復雜化。本研究的目的旨在通過系統(tǒng)的流行病學監(jiān)測了解近年來不同基因型IBV在我國的流行狀況，通過生物信息學分析闡明不同IBV基因型間遺傳演化的規(guī)律和發(fā)展趨勢，并針對流行

3、的優(yōu)勢基因型毒株研制新型疫苗。
　　 1、2009-2011年間國內IBV流行病學監(jiān)測與流行株的遺傳進化分析
　　 2009～2011年間，共從國內主要養(yǎng)雞省份分離到IBV流行毒株54株，其中肉雞源毒株52株，蛋雞源毒株2株。在肉雞源毒株中我們發(fā)現(xiàn)存在較高比例的IBV與H9亞型AIV的混合感染(25/52)，發(fā)生混合感染的雞群往往發(fā)病更為嚴重，且混合感染樣品對接種的雞胚表現(xiàn)出更強的致病性，該結果提示這兩種病毒之間可能存在

4、一定程度的致病協(xié)同作用。對所有分離毒株S1基因進行克隆和基因測序，共發(fā)現(xiàn)4種不同的S1基因長度，分別為1611bp、1617bp、1620bp和1626bp，說明S1基因中堿基的插入和缺失是一種非常普遍的現(xiàn)象。將54個分離株S1基因序列和近年來在國內及周邊國家和地區(qū)流行的13個基因型共57個參考毒株的S1基因序列用Mega4.1軟件進行遺傳進化分析，結果顯示54個分離株可以分為QX型(42株)、HN-08型(5株)、LSC/99I型(2

5、株)、TW-Ⅰ型(2株)、Mass型(1株)、793/B型(1株)和CHⅢ型(1株)等7個基因型。在所有分離株中，QX型分離株數(shù)量最多，占總數(shù)的77.8％(42/54)。從進化樹中還可以看出，QX型分離株又可以進一步細分為兩個不同的基因亞群——ClusterⅠ(21株)和ClusterⅡ(21株)，經典的QX型參考毒株QXIBV和LX4株均屬于ClusterⅠ亞群，而ClusterⅡ亞群中的毒株均在2010年才開始出現(xiàn)。為了更加系統(tǒng)地描

6、述同期內國內不同基因型IBV的分布情況，我們將已經在GenBank發(fā)表全長S1基因序列的所有同時期分離株共296株合并進行遺傳進化分析，結果顯示，350個同時期分離株可分為19個基因型，其中11個基因型均能根據(jù)現(xiàn)有文獻報道找到同源的參考毒株，根據(jù)各基因型中包含的毒株數(shù)量多少依次為:QX型(219株)、HN-08型(26株)、LSC/99Ⅰ型(22株)、LDT3/03型(12株)、TW-Ⅰ型(12株)、CHⅢ型(11株)、Mass型(10

7、株)、LDL/97Ⅰ型(3株)、CHⅥ型(3株)、TW-Ⅱ型(2株)和793/B型(1株)，此外還有8個基因型未能歸入已被正式命名的已知基因型，因此暫定名為未定型Ⅰ～未定型Ⅷ。從分型結果可以看出，我國流行的IBV基因型具有典型的地域性分布特征，大多數(shù)在周邊國家和地區(qū)廣泛流行的基因型在我國并未發(fā)現(xiàn)。為闡明國內不同基因型毒株之間的遺傳演化關系，根據(jù)遺傳進化和基因分型的結果，從不同基因型中選擇代表性毒株，用RDP3.31軟件對S1基因進行重組

8、分析。結果顯示當前國內流行的毒株中存在廣泛的重組現(xiàn)象，不同基因型間的重組事件不僅導致同一基因型內部發(fā)生分化，出現(xiàn)了不同基因亞群，而且經過多次的同源重組后可能會導致新的基因型毒株的出現(xiàn)。綜合不同基因型間發(fā)生的系列重組事件，可以推斷:QX型、LSC/99Ⅰ型、793/B型、LDL/97Ⅰ型、TW-Ⅰ型和TW-Ⅱ型是目前在我國流行的所有基因型毒株的原型毒株，除此以外的新出現(xiàn)的基因型均是在這6個基因型的基礎上經過一次或多次的同源重組而產生的變異

9、株。
　　 2、Mass型H120活疫苗對當前流行的主要基因型代表毒株的免疫保護效力試驗根據(jù)遺傳進化分析的結果，從當前主要流行的三個IBV基因型中挑選出4個代表毒株:AH/2009/1(QX型ClusterⅠ亞群)、JS/2010/12(QX型ClusterⅡ亞群)、JS/2009/5(LSC/99Ⅰ型)和JS/2010/6(HN08型)，分別用Mass型IBV活疫苗(H120株)進行免疫保護效力試驗，以評價現(xiàn)有疫苗對流行毒株的

10、免疫保護狀況。結果顯示H120疫苗株對不同基因型的IBV毒株免疫保護效力存在較大差異，對同屬于Mass基因型的M41強毒株能夠提供完全保護，且能顯著降低攻毒后氣管和腎臟的排毒率;對于QX型毒株AH/2009/1和JS/2010/12，基本達到臨床保護標準，但試驗雞氣管和腎臟帶毒的比例遠遠高于M41攻毒組，說明局部免疫保護效果不是非常理想;對于HN08型的JS/2010/6株和LSC/99Ⅰ型的JS/2009/5株保護效果均不理想，攻毒后

11、雞群表現(xiàn)出較為嚴重的臨床癥狀和相當高的氣管和腎臟排毒率。該結果提示我們，現(xiàn)有疫苗已經不能對當前流行的主要基因型毒株提供良好的免疫保護，急需研究開發(fā)與流行毒株基因型一致的新疫苗用于該病的防控。
　　 3、以馬立克病毒為載體研制QX型IBV基因工程疫苗本研究以MDVCV1988/Rispens疫苗毒株為載體，以其IRS-US間隔區(qū)作為插入位點，選擇網(wǎng)狀內皮組織增生癥病毒(REV)基因組長末端重復序列(LTR)作為啟動子，構建含QX型

12、IBV分離株CK/CH/JS/06ⅡS1基因及報告基因EGFP的轉移載體pUP-LTR-EGFP-S1-DOWN。將MDV基因組DNA與轉移載體共轉染雞胚成纖維細胞(CEF)，經同源重組獲得重組病毒，通過多輪熒光篩選和純化，最終獲得的重組病毒命名為rMDV-EGFP-S1。進一步通過Cre重組酶介導的重組反應敲除EGFP報告基因，獲得僅帶有LTR啟動子和S1基因的重組病毒，命名為rMDV-S1。通過PCR和間接免疫熒光試驗(IFA)對重

13、組病毒進行鑒定，結果表明S1基因完全按照預定方式正確插入到MDV基因組中并能夠表達S1蛋白。將重組病毒在CEF上進行連續(xù)30代傳代培養(yǎng)，經PCR和IFA試驗鑒定，該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 重組病毒rMDV-S1對Qx型IBV強毒株CK/CH/JS/06Ⅱ的免疫攻毒保護效力試驗結果顯示，重組病毒按5×103PFU/羽的劑量免疫1日齡SPF雞，免疫后4w攻毒，免疫組試驗雞發(fā)病率和死亡率分別為30％和5％，對照組則分別為

14、100％和30％，經x2檢驗差異顯著(p＜0.05)。排毒檢測結果顯示，免疫組氣管排毒率在攻毒后部分時間點與對照組相比差異顯著，攻毒后14d撲殺時腎臟排毒率差異極顯著(p＜0.01)。免疫組試驗雞攻毒后的增重未受明顯影響，與對照組相比差異顯著(p＜0.05)。病理組織學檢查結果顯示與對照組相比免疫組試驗雞腎臟的病變程度相對較輕。所有結果均表明重組病毒對QX型強毒株的攻擊能夠提供良好的免疫保護。
　　 重組病毒對MDV強毒株RB1