表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒gD、gE基因的重組馬立克氏病毒構(gòu)建.pdf

1、雞傳染性喉氣管炎(infectious laryngotracheitis，LIT)是由傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)所引起的急性呼吸道傳染病。本病由于發(fā)病率高，減緩生長和引起產(chǎn)蛋下降等特點(diǎn)給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外的研究表明，目前使用的ILTV弱毒疫苗容易毒力返強(qiáng)，ILT的暴發(fā)大多與雞胚源弱毒疫苗(CEO)的使用有關(guān)。因此，研制安全、有效的新型疫苗對(duì)于ILT的

2、防控具有重要意義。
　　本研究以ILTV Anhui-2011-2株DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增ILTV gD、gE基因;利用馬立克氏病毒(MDV) CVI988/Rispens疫苗株基因組IRS-US連接區(qū)同源序列、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白(EGFP)基因，構(gòu)建含gD、gE基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLTR-EGFP-gD和pLTR-EGFP-gE。以磷酸鈣沉淀法將轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒和MDV CVI98

3、8/Rispens基因組DNA共同轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，通過篩選、純化得到帶EGFP標(biāo)志的重組病毒rMDV-EGFP-gD和rMDV-EGFP-gE。利用Cre重組酶去除rMDV-EGFP-gD和rMDV-EGFP-gE基因組中EGFP基因，重新轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，經(jīng)篩選、純化得到不含EGFP基因的重組病毒rMDV-gD和rMDV-gE。經(jīng)Western blot分析，重組病毒rMDV-gD和rMDV-gE可分別表達(dá)ILTV gD蛋

4、白和gE蛋白。
　　本研究評(píng)價(jià)了1日齡SPF雞接種重組病毒rMDV-gD和rMDV-gE后對(duì)ILTVAnhui-2011-2株及MDV RB1B強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)效力。其中，重組病毒對(duì)ILT的免疫保護(hù)試驗(yàn)設(shè)立rMDV-gD免疫組、rMDV-gE免疫組、ILT CEO疫苗免疫組、非免疫攻毒對(duì)照組和健康對(duì)照組，從發(fā)病率、死亡率、臨床癥狀、病理組織學(xué)變化、對(duì)增重的影響和抗體水平等方面評(píng)價(jià)免疫效力。rMDV-gD免疫組在ILTV攻毒后的發(fā)病

5、率(35％)和死亡率(5％)與非免疫攻毒對(duì)照組（發(fā)病率100％，死亡率36.8％）存在顯著差異(p＜0.05); rMDV-gE免疫組的死亡率(19％)與非免疫攻毒對(duì)照組差異不顯著(p＞0.05)。攻毒前后(42日齡～52日齡）各免疫組增重差異不顯著(p＞0.05)，但CEO疫苗組增重最小(0.113 kg)。間接ELISA檢測各免疫組攻毒前后的血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示抗體效價(jià)的高低與保護(hù)效力之間沒有相關(guān)性。經(jīng)病理組織學(xué)檢查，攻毒后rMD