1型鴨甲肝病毒2A蛋白功能初探.pdf

1、鴨甲型肝炎病毒(DHAV)屬于小RNA病毒科的禽肝病毒屬，對(duì)雛鴨具有高致病性和高致死率，具有傳播迅速的特點(diǎn)。為了探究其2A蛋白的功能，我們開(kāi)展了2A蛋白生物信息學(xué)特性、2A2和2A3蛋白的原核表達(dá)純化、制備抗2A1/2A2/2A3蛋白的多克隆抗體、2A1蛋白自我切割功能、2A2和2A3蛋白的完整性和獨(dú)立性、2A2蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、2A2蛋白的GTPase活性等項(xiàng)研究。獲如下結(jié)果:
　　1、2A蛋白的生物信息學(xué)特性分析
　　通

2、過(guò)NetPicoRna V1.0在線服務(wù)器預(yù)測(cè)2A蛋白的切割位點(diǎn):2A1和2A2之間的切割位點(diǎn)是NPG/P，2A2和2A3之間的切割位點(diǎn)是S/H;運(yùn)用ClustalW軟件對(duì)DHAV-1的2A蛋白與其他小RNA病毒的2A蛋白進(jìn)行多重蛋白質(zhì)序列比對(duì)，經(jīng)GeneDoc軟件進(jìn)行整理編輯，結(jié)果表明DHAV-1的2A蛋白是由NPGP樣的2A1、GTPase樣的2A2和H-NC樣的2A3組成。將2A2氨基酸序列輸入MEGA6.0，通過(guò)neighbou

3、r-joining(NJ)方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)以及用SWISS-MODEL服務(wù)器對(duì)2A2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)分析表明2A2蛋白與GTPase家族具有相同的進(jìn)化來(lái)源和結(jié)構(gòu)上的相似性。
　　2、2A2蛋白和2A3蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫印跡試驗(yàn)
　　根據(jù)2A2和2A3的基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物P1P2和P3P4，從含DHAV-1的鴨胚尿囊液中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成eDNA并作為模板，PCR擴(kuò)增分別獲得2A2基因和2A3基因片段

4、，克隆至pMD19-T載體，鑒定正確后，再分別亞克隆至pET-32(a)+原核表達(dá)載體。獲得2A2蛋白和2A3蛋白的最佳表達(dá)條件均為用0.4 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)4h;2A2蛋白可經(jīng)洗滌包涵體的方式純化，2A3蛋白通過(guò)Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠親和層析進(jìn)行純化。表達(dá)的兩種蛋白經(jīng)免疫印跡證實(shí)能夠被鴨抗DHAV-1抗體識(shí)別。
　　3、鼠或兔抗2A1、2A2和2A3蛋白多克隆抗體的制備
　　人工合成的2A1蛋白多肽免

5、疫小鼠制備鼠抗2A1蛋白的多克隆抗體，通過(guò)ELISA測(cè)得其抗體效價(jià)為1∶6400;經(jīng)包涵體洗滌純化的2A2蛋白分別免疫小鼠和兔子制備鼠抗和兔抗2A2蛋白的多克隆抗體，結(jié)果鼠抗和兔抗的瓊擴(kuò)效價(jià)均為1∶16;通過(guò)Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠親和層析純化的2A3蛋白免疫兔子制備兔抗2A3蛋白的多克隆抗體，其瓊擴(kuò)效價(jià)最高為1∶32。
　　4、2A1蛋白的自我切割試驗(yàn)
　　根據(jù)紅色熒光蛋白(RFP)的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1P2，以pD

6、sRED載體為模板，擴(kuò)增RFP片段;將2A1基因的反向互補(bǔ)序列插入到P2的5’端，即得到了擴(kuò)增RED-2A1片段的下游引物P3，利用引物P1P3，以pDsRED載體為模板，擴(kuò)增RED-2A1片段;將RFP片段和RED-2A1片段分別插入pEGFP-N1，獲得含有雙熒光報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pRED-EGFP和pRED-2A1-EGFP;將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)，在熒光顯微鏡下可以看到同一視野中的細(xì)胞發(fā)出紅色和綠色兩種

7、熒光，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;分別提取轉(zhuǎn)染了pRED-EGFP、pRED-2A1-EGFP、pDsRED和pEGFP-N1四種質(zhì)粒后的細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后，分別用抗2A1蛋白抗體、抗紅色和綠色熒光蛋白的抗體做免疫印跡，結(jié)果表明2A1蛋白具有自我切割的功能。
　　5、2A2和2A3蛋白完整性、獨(dú)立性試驗(yàn)
　　DHAV-1接種DEF后72 h時(shí)，收集并裂解細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞裂解液上清分為兩份并分別與兔抗2A2和2A3

8、蛋白抗體進(jìn)行免疫沉淀(IP)試驗(yàn)，結(jié)果兩種不同的抗體沉淀出了兩種分子量不同的蛋白;用鴨抗DHAV-1抗體經(jīng)免疫印跡分析表明這兩種蛋白分別為2A2和2A3蛋白。感染DHAV-1后的DEF進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)，同一細(xì)胞同時(shí)用兩種不同的一抗（兔抗2A3蛋白抗體和鼠抗2A2蛋白抗體）進(jìn)行孵育，再用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG和TRITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG的二抗同時(shí)進(jìn)行孵育，試驗(yàn)結(jié)果表明2A2蛋白主要定位在細(xì)胞核中，少量定位在細(xì)胞質(zhì)中，而

9、2A3蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，少量定位在細(xì)胞核中。IP及IFA結(jié)果表明DHAV-1的2A2蛋白與2A3蛋白是兩個(gè)相互獨(dú)立的蛋白。
　　6、2A2蛋白誘導(dǎo)鴨胚成纖維細(xì)胞凋亡試驗(yàn)
　　將已構(gòu)建好的pMD19-T/2A2質(zhì)粒與pcDNA3.1(+)空載分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行連接，成功獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/2A2，并將其轉(zhuǎn)染DEF，36 h時(shí)收獲細(xì)胞，通過(guò)IFA及免疫印跡分析表明2A2蛋白在DEF中

10、表達(dá)。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48 h時(shí)收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞的DNA，經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳可以看到明顯的DNA Ladder;通過(guò)HE染色和DAPI細(xì)胞核染色可以看到細(xì)胞核出現(xiàn)邊移、碎裂的凋亡現(xiàn)象;TUNEL法觀察到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染成深棕色;經(jīng)過(guò)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/2A2的實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞的比率明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的對(duì)照組。結(jié)果表明DHAV-1的2A2蛋

11、白能夠誘導(dǎo)DEF凋亡。
　　7、2A2蛋白的GTP酶活性試驗(yàn)
　　誘導(dǎo)原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32(a)+/2A2表達(dá)，將表達(dá)于上清中的2A2蛋白通過(guò)Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠親和層析進(jìn)行純化，利用GTP酶試劑盒驗(yàn)證其是否具有GTPase活性。結(jié)果表明DHAV-1的2A2蛋白在室溫下30 min就能夠水解GTP產(chǎn)生游離的磷酸根，其與試劑盒中的孔雀綠試劑反應(yīng)形成深綠色的產(chǎn)物，在620 nm處測(cè)定其吸光值(0.627)，與空載組的吸