鴨甲肝病毒3’非編碼區(qū)功能及干擾素信號通路研究.pdf

1、鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）引起的鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，主要病發(fā)于1～3周齡的雛鴨，可引起90％以上的死亡率，而35日齡以上的鴨感染DHAV后僅見一過性的精神沉郁。另外，臨床感染DHAVs的病、死雛鴨盡管日齡不同，但同一臟器中病毒含量類似，這提示我們DHAV可以逃逸雛鴨尚未發(fā)育完善的免疫系統(tǒng)而增殖、致病。DHAV作為小RN

2、A病毒科禽肝病毒屬的唯一成員，包括三個基因型，分別對應(yīng)于三個血清型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。目前對該病毒的研究已經(jīng)從基因檢測、克隆測序、進(jìn)化樹分析等過渡到了對其基因組功能和病毒與宿主之間相互作用的研究。
　　小RNA病毒3’UTR中存在的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、Poly(A)尾等二級結(jié)構(gòu)可以通過與病毒其他部位、病毒蛋白或宿主細(xì)胞的蛋白相互作用來實(shí)現(xiàn)對病毒復(fù)制和翻譯的調(diào)控，并以此影響病毒的感染力，目前盡管已對多種小RNA病毒3’U

3、TR的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了研究，其調(diào)控病毒復(fù)制和翻譯的分子機(jī)制也得到了部分闡明，但關(guān)于DHAV3’UTR結(jié)構(gòu)與功能的研究在國際上仍屬于空白區(qū)?；诖?，本課題以本實(shí)驗(yàn)室前期制備的DHAV-1（LY0802株）和DHAV-3(SD1201株)DNA-Launched（DHAV-1L,DHAV-3L）傳染性克隆為基礎(chǔ)，研究了DHAV-1和DHAV-33’UTRs對病毒感染力的影響。另外本研究結(jié)合DHAV感染DEF后的RNA-seq分析，對DHAV

4、感染的干擾素信號通路進(jìn)行了研究，嘗試從機(jī)體免疫、病毒與機(jī)體相互作用的層面入手，通過機(jī)體免疫功能的變化來解釋鴨病毒性肝炎的致病機(jī)理。
　　（1）DHAV3’UTR對病毒感染力的研究
　　本研究從NCBI收錄的DHAV毒株中隨機(jī)選取5株DHAV-1、2株DHAV-2和5株DHAV-3分別進(jìn)行Megalian分析，發(fā)現(xiàn)相同基因型的DHAV3’UTR具有相對保守的序列，而不同基因型DHAV的3’UTR序列中存在有共有基序α和β。使用

5、RNAfold在線軟件預(yù)測LY0802和SD11013’UTR的二級結(jié)構(gòu)，除了poly(A)外，發(fā)現(xiàn)LY0802的3’UTR存在7個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，SD1101的3’UTR存在3個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而保守序列α位于1L-C和3L-B莖環(huán)區(qū)，β位于1L-FG和3L-C莖環(huán)區(qū)。據(jù)此，本研究根據(jù)RNAfold預(yù)測結(jié)果構(gòu)建了一系列的DHAV-1和DHAV-33’UTR缺失株。首先通過透射電鏡驗(yàn)證了DNA-Launched的病毒裝載有效性并發(fā)現(xiàn)DHAV-13’

6、UTR全部缺失毒可以感染DEF并對宿主細(xì)胞造成輕微病變，這初步說明3’UTR對DHAV-1在細(xì)胞上的增殖是非必需的。接著本研究通過熒光定量PCR、間接免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)從基因和蛋白水平上對DHAV3’UTR突變病毒在細(xì)胞中的增殖進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定，結(jié)果證實(shí)了DHAV3’UTR對病毒的增殖有很大影響但并不是必需的。為了鑒定DHAV3’UTR的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，本研究通過分子病毒轉(zhuǎn)染和感染兩種模式，鑒定出了DHAV-13’UTR的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域

7、C和G、DHAV-33’UTR的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域C，另外，結(jié)合DHAV感染DEF后的RNA-seq分析，1Δ1-314和1Δ1-339引起的宿主表達(dá)差異基因分別為415個（上調(diào)178，下調(diào)237）和4033個（上調(diào)1755，下調(diào)2278），我們證實(shí)雖然Poly(A)尾對DHAV-1病毒的復(fù)制不是必需的，但它的確可以影響DHAV的感染力。
　?。?）DHAV感染DEF后的轉(zhuǎn)錄組測序分析
　　DHAV-1L感染DEF細(xì)胞后對宿主細(xì)胞的

8、mRNA做轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因5828個，其中上調(diào)基因?yàn)?025個，下調(diào)基因?yàn)?803個。所有差異基因被歸類注釋為67條GO term，涉及生物學(xué)過程（biological processes,BP）、細(xì)胞組分（cellular components,CC）及分子功能（molecular functions,MF）三大類。根據(jù)KEGG注釋結(jié)果，差異表達(dá)基因富集在35條信號通路，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最為富集，其次為內(nèi)分泌系統(tǒng)通路和免

9、疫系統(tǒng)通路。在與先天免疫相關(guān)的Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、RIG-I受體信號通路（RIG-I-like receptor signaling pathway）和NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）三大模式識別受體信號通路中，DHAV感染組宿主的IκB、IL-6和IL-8在這三個通路中都有顯著上調(diào)，另外在Tol

10、l樣受體信號通路中，P13K、TRAF3和TBK1有顯著下調(diào)，在RIG-I受體信號通路中，基因TRAF3、TBK1和MEKK1有顯著下調(diào)，在NOD樣受體信號通路中，Erbin有顯著下調(diào)。IκB顯著上調(diào)可以抑制NF-κB的解離入核，TRAF3和TBK1的顯著下調(diào)抑制了IKKε/TBK1的活性從而阻止IRF3/7的轉(zhuǎn)錄活性。這兩條通路共同抑制IFN-β的表達(dá)。據(jù)此我們推測DHAV-1L感染DEF后宿主干擾素基因或未得轉(zhuǎn)錄。
　?。?）

11、DHAV-1感染DEF后的干擾素信號通路研究
　　本研究用等量DHAV-1L感染DEF后，分別于4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h收集感染DHAV的DEF上清和細(xì)胞，對細(xì)胞總RNA進(jìn)行干擾素β基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHAV-1L在DEF中的復(fù)制沒有引起宿主細(xì)胞干擾素β基因的轉(zhuǎn)錄。然后又以聚肌胞轉(zhuǎn)染感染DHAV-1的DEF細(xì)胞作為陽性對照，用酶聯(lián)免疫法檢測DEF細(xì)胞上清中干擾素蛋白的分泌，并用熒光定量 PCR檢測干擾素誘