美洲牡蠣(Crassostrea virginica)抗病相關基因標記的篩選及應用.pdf

1、美洲牡蠣(Crassostrea virinica)天然分布于大西洋西岸和墨西哥灣,是美國重要的經(jīng)濟貝類。上個世紀中期,美洲牡蠣曾遭受兩種原生動物病害(MSX和Derrno)的重創(chuàng),無論養(yǎng)殖群體還是野生群體,均出現(xiàn)高感染率、高死亡率的現(xiàn)象,這使美國東海岸的養(yǎng)殖業(yè)幾乎崩潰。本研究通過候選基因法和RAD測序的方法篩選美洲牡蠣抗病相關基因標記,并利用已知抗病相關的分子標記和中性的分子標記分析寄生蟲病對特拉華灣美洲牡蠣群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響。

2、>　　1.絲氨酸蛋白酶抑制因子1基因(cvSI-1)和美洲牡蠣抗病性狀的相關性通過分析美洲牡蠣cvSI-1基因的SNV198位點在抗病品系、易感品系及其野生基群體,具有不同病害感染史的野生群體和處于同一流域,但具有不同病害選擇壓力的野生群體中和抗病性狀的相關性,本研究發(fā)現(xiàn)SNPl98位點C等位基因和美洲牡蠣的抗Dermo性狀緊密相關。但SNP198是個同義突變,不改變編碼氨基酸的序列,所以本研究還分析了SNP198位點和cvSI-1基因

3、5'調(diào)控區(qū)多態(tài)性位點的連鎖性來解釋其抗病相關性。通過染色體步移和重測序的方法,獲得長631 bp的5'調(diào)控區(qū),包含22個SNPs和3個插入/缺失多態(tài)性位點。利用野生群體死亡前和死亡后的材料,分析5'調(diào)控區(qū)-404位,長25 bp的插入/缺失位點和SNP198位點的連鎖性。在Dermo造成大部分死亡的死亡后群體中,-404插入/缺失的缺失等位基因上升了14.4％(p=0.0595),而SNP198的C等位基因僅上升了3.4％(p=0.57

4、56)。缺失等位基因和C等位基因在80.3％的牡蠣中具有連鎖性。具有缺失等位基因的牡蠣經(jīng)Dermo病原體Perkinsusmarinus感染后,其cvSI-1的表達量顯著提高(p=0.017)。本研究結(jié)果提示我們,5,調(diào)控區(qū)的變異會提高cvSI-1的轉(zhuǎn)錄活性,因此通過抑制寄生蟲的蛋白酶活性而對其產(chǎn)生抗性。
　　2.絲氨酸蛋白酶抑制因子2基因(cvSI-2)和美洲牡蠣抗病性狀的相關性一種新的絲氨酸蛋白酶抑制因子,cvSI-2,已經(jīng)從

5、美洲牡蠣的細胞質(zhì)中分離出來,其能夠體外抑制P.marinus的活性。本研究分析了cvSI-2基因的多態(tài)性和美洲牡蠣抗病性狀的相關性。利用cvSI-2的cDNA序列搜索NCBI數(shù)據(jù)庫,共得到33條美洲牡蠣的EST序列。將低質(zhì)量的序列去除后,27條高質(zhì)量的EST序列用于比對和SNP位點的篩查,獲得5個高質(zhì)量SNP位點,包括4個同義突變和1個非同義突變。隨后,對非同義突變SNP226(A/G)和美洲牡蠣的抗病相關性進行分析。SNP226的GG

6、基因型在兩個家系死亡后的材料中分別上升17.0％(p=0.0005)和16.9％(p=0.0634)。另外,SNP226的G等位基因在選育的抗病品系中的頻率最高,為93.5％,顯著高于其野生基群體CTW(69.6％)和兩個選育的易感品系FMF(63.0％)和UMFS(51.3％)。在Martha's Vineyard、特拉華灣和切斯皮克灣三個不同水域,病害選擇壓力大的野生群體G等位基因頻率都要高于病害選擇壓力小的群體。SNF226的G等

7、位基因編碼纈氨酸,A等位基因編碼異亮氨酸。此位的纈氨酸可能能夠增強cvSI-2蛋白和Dermo病原體絲氨酸蛋白酶結(jié)合的親和性,從而增強了抑制其活性的能力,最終在美洲牡蠣的抗Dermo病害方面發(fā)揮重要作用。
　　3.美洲牡蠣高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及抗病性狀的QTL定位利用RAD測序技術,構(gòu)建了美洲牡蠣高密度遺傳連鎖圖譜。通過分析標記死亡前后基因型頻率的變化,定位抗病性狀相關的QTL。雌性連鎖圖譜含12個連鎖群,共1,350個標記,

8、覆蓋1,081.24 cM,最大圖距12.24 cM,平均圖距0.80 cM,覆蓋率為98.14％。雄性連鎖圖譜含10個連鎖群,共1,236個標記,覆蓋723.61 cM,最大圖距10.05 cM,平均圖距0.59 cM,覆蓋率為98.28％。雌性圖譜中,88個標記在死亡后群體中基因型頻率發(fā)生顯著變化(p<3.74×10-5,經(jīng)Bonferroni校正后的P值),其中有62個(76.30/％)標記是成對或者成簇分布。雌性圖譜檢測到11個

9、高精度QTL,分布在5個連鎖群,其中第8號連鎖群的QTL數(shù)目最多,為4個。雄性圖譜中,80個標記在死亡后群體中基因型頻率發(fā)生顯著變化(p<4.04×10-5,經(jīng)Bonferroni校正后的P值),其中有57個(71.3％)標記是成對或者成簇分布。雄性圖譜檢測到5個高精度的QTL,分布在4個連鎖群,在第7號連鎖群檢測到2個。
　　4.病害對特拉華灣美洲牡蠣幼體群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響本研究利用8個抗病相關的SSR標記和9個中性的SSR標記

10、對特拉華灣由北向南Hope Creek(HC)、Round Island(RI)、Beadons(BD)及Cape Shore(CS)4個采樣點的美洲牡蠣幼體群體進行了群體遺傳學分析。如果用17個微衛(wèi)星位點分析兩兩群體間的遺傳分化系數(shù)(Fst),Fst的分布范圍為-0.0016-0.0015。最南部群體CS和最北部群體HC間的Fst值最大,為0.0015,但是和0沒有顯著性差異(p>0.0083,經(jīng)Bonferroni校正后的P值)。如

11、果用8個抗病相關的微衛(wèi)星位點進行分析,Fst的分布范圍為-0.0052-0.0013。CS群體和HC群體間的Fst值最大,為0.0013。但是其Fst值仍和O沒有顯著性差異(p=0.8417)。同樣地,中性的微衛(wèi)星位點也沒有檢測到這4個群體間的遺傳分化。這說明特拉華灣幼體群體是個均一的大群體,沒有出現(xiàn)遺傳分化。
　　5.特拉華灣美洲牡蠣群體有效群體大小(Ne)的估算具有高繁殖力和I1l型存活類型的美洲牡蠣中極有可能存在“少數(shù)個體維

12、持大群體”的現(xiàn)象。為了驗證特拉華灣美洲牡蠣群體中是否存在這種現(xiàn)象,本研究估算了其有效群體的大小(Ne),并比較特拉華灣的Ne在不同病害選擇壓力群體間和時間上的變化。對特拉華灣5個采樣點,2006年和2009年成體牡蠣和幼體牡蠣群體樣品在7個中性的SSR位點進行分型,利用三個雙樣品法和兩個單樣品法估測特拉華灣美洲牡蠣群體的Ne。結(jié)果顯示,成體牡蠣和幼體牡蠣間的基因豐富度沒有顯著性差異,從而不支持“少數(shù)個體維持大群體”,的理論。5種方法估算

13、得到的Ne值差異較大,總體而言,所得Ne值較小,并且通常沒有獲得有效的上限估算值。幼體群體的Ne值分布范圍是140-440,比成體群體的Ne值要小(589-2,779)。通過混合所有成體的樣品所估算的Ne值提示著整個海灣的有效群體大小可能較大。本研究結(jié)果表明,特拉華灣某一批幼體牡蠣可能是由少數(shù)的成體牡蠣繁殖而來的,并存在一定的遺傳漂變。但是這種小范圍的遺傳漂變并不影響整個灣成體群體的遺傳變化,因為成體群體是每年很多批幼體群體積累多年的結(jié)