福建牡蠣(Crassostrea angulata)幼體變態(tài)相關(guān)基因及蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、附著和變態(tài)是海洋無脊椎動物幼體生活史中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，變態(tài)的成功與否與種群動態(tài)密切相關(guān)。這一過程涉及到行為和形態(tài)學(xué)上激烈的變化，也涉及復(fù)雜的分子生物學(xué)過程。福建牡蠣（Crassostrea angulata）又稱葡萄牙牡蠣，是我國東南沿岸重要的主導(dǎo)養(yǎng)殖貝類之一。本文采用分子生物學(xué)方法，研究福建牡蠣幼體附著和變態(tài)過程中相關(guān)功能基因的作用，探討幼體附著和變態(tài)的分子機制，期望為貝類早期發(fā)育生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)提供新資料，也為牡蠣人工育苗技術(shù)改進(jìn)

2、提供理論基礎(chǔ)。
　　 本研究從福建牡蠣幼體轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得了腎上腺素受體基因的EST片段序列，利用末端快速擴增技術(shù)(RACE)首次從福建牡蠣幼體獲得腎上腺素受體基因cDNA序列，全長1833 bp。蛋白序列與肩突硬蜱的α型腎上腺素受體關(guān)系最近，氨基酸序列包含七次跨膜結(jié)構(gòu)域，這是G蛋白耦聯(lián)受體標(biāo)志性的特征。還含有一個相對較長的第三細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和一個較短的第四尾部結(jié)構(gòu)域，這也是α型腎上腺素受體的特征。熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)腎上腺

3、素受體在福建牡蠣成體各組織都有分布，其中在外套膜和唇瓣組織表達(dá)量相對較高。同時還檢測了腎上腺素受體在福建牡蠣幼體不同發(fā)育時期的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著幼體的發(fā)育腎上腺素受體基因的表達(dá)不斷升高，在附著變態(tài)前表達(dá)最高，隨后開始逐漸下降。通過整體原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)腎上腺素受體主要定位在牡蠣幼體的頂點神經(jīng)節(jié)周圍，在幼體足和心臟的部位也有相對集中的分布。腎上腺素誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn)，腎上腺素受體的表達(dá)受腎上腺素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。
　　 同樣利用RACE技術(shù)獲得了

4、蛋白激酶C受體(RACK)基因序列，全長1148bp，編碼317氨基酸。從福建牡蠣幼體獲得RACK基因編碼的蛋白序列不僅與軟體類有很高的相似性，與魚類、兩棲類甚至是哺乳類都有非常高的相似度，說明了RACK基因在歷史進(jìn)化過程中具有高度的保守性。利用cDNA序列設(shè)計引物，PCR獲得了RACK基因的基因組序列，發(fā)現(xiàn)RACK基因組有7個外顯子和6個內(nèi)含子。對不同組織和發(fā)育時期的幼體檢測，發(fā)現(xiàn)RACK在不同組織中都有分布，無組織特異性，但在不同發(fā)

5、育時期的幼體中RACK基因會在變態(tài)過程中大量表達(dá)，說明了此基因與幼體的變態(tài)有著密切關(guān)聯(lián)。通過去甲腎上腺素誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn)RACK基因和蛋白激酶C基因都會表達(dá)明顯上調(diào)，說明了PKC/RACK信號通路在福建牡蠣幼體附著變態(tài)過程中起了重要的作用。
　　 利用RACE克隆獲得了兩個凋亡基因Ca-Caspase2和Ca-Caspase3，Ca-caspase2序列全長2528 bp，開放閱讀框為1923 bp，編碼641個氨基酸。軟件推測蛋白

6、序列的分子量為72.1 kD，等電點為6.66。Ca-Caspase2屬于凋亡起始基因，在Caspase主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路中處于起始位置，負(fù)責(zé)凋亡信號的傳導(dǎo)。Ca-Caspase3序列全長1381 bp，開放閱讀框為1215 bp，編碼404個氨基酸。軟件推測蛋白序列的分子量為46.1 kD，等電點為5.4。Ca-aspase2和Ca-aspase3基因都含有P10和P20大小亞基結(jié)構(gòu)域，且含有保守的絲氨酸活性中心序列“QACRG”

7、和組氨酸活性標(biāo)簽。Ca-Caspase3屬于凋亡執(zhí)行基因，處于細(xì)胞凋亡信號通路中末端，參與細(xì)胞凋亡的生理過程。利用整體原位雜交技術(shù)，將Ca-Caspase2和Ca-Caspase3基因表達(dá)定位在牡蠣幼體變態(tài)時期的面盤和足上，Ca-Caspase2可能介導(dǎo)了牡蠣幼體足部細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)和蛋白激活，而Ca-Caspase3在幼體足部和面盤的消亡方面都起作用。
　　 成功構(gòu)建了帶有胰島素相關(guān)多肽受體基因的pGBKT7-IRR誘餌質(zhì)粒

8、和福建牡蠣幼體帶有接頭序列的cDNA文庫，然后與帶有接頭序列的pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)染酵母菌株AH109，通過在營養(yǎng)缺陷酵母培養(yǎng)基上生長，篩選獲得與胰島素相關(guān)多肽受體有相互作用的基因IRRBP。通過比對搜索發(fā)現(xiàn)只有在太平洋牡蠣中發(fā)現(xiàn)IRRBP基因的同源序列，所以就目前來看IRRBP應(yīng)該是牡蠣特有的一種基因。IRRBP基因在福建牡蠣幼體變態(tài)時期表達(dá)顯著升高。在成體不同組織表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，外套膜和鰓組織表達(dá)量明顯高于其它各組織，利用組織切片

9、原位雜交發(fā)現(xiàn)IRRBP基因主要表達(dá)在外套膜和鰓組織的表皮細(xì)胞中。以上結(jié)果表明IRRBP基因?qū)ν馓啄ず亡w組織的生長具有重要作用，推測IRRBP可能是牡蠣特有的一種與生長密切相關(guān)的結(jié)合因子。
　　 利用雙向電泳技術(shù)對福建牡蠣幼體附著變態(tài)前和附著變態(tài)過程中蛋白質(zhì)組進(jìn)行差異表達(dá)分析。經(jīng)質(zhì)譜鑒定出來39種蛋白表達(dá)差異，并對39種差異蛋白進(jìn)行了功能分類，利用熒光定量PCR技術(shù)驗證了其中10個蛋白點的基因表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)有9個蛋白質(zhì)點的mRNA

10、表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平是一致的，有一個是相反的。發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)點中有幾個酶蛋白都是關(guān)于營養(yǎng)物質(zhì)消耗的，如乙酰輔酶A脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶。還有一個是精氨酸激酶，這是調(diào)節(jié)自身能量平衡的關(guān)建酶，也是無脊椎動物特有的一個能量存儲方面的蛋白酶。還有一個是ATP合成酶，這些酶蛋白表達(dá)差異的變化說明了福建牡蠣幼體在變態(tài)過程中大量消耗自身營養(yǎng)物質(zhì)來供給能量的需要。還有兩種結(jié)構(gòu)蛋白:筑絲蛋白和鈣網(wǎng)蛋白，筑絲蛋白主要是纖毛或鞭毛的