MYB44對HrpNEa誘導擬南芥抗蟲防衛(wèi)信號傳導的調(diào)控作用.pdf

1、Harpins是由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的一種多效應(yīng)蛋白質(zhì)。其中HrpNEa研究比較透徹，早期實驗表明外施HrpNEa能誘導植物包括抗蟲性在內(nèi)的多種抗性。研究發(fā)現(xiàn)HrpNEa誘導后能抑制擬南芥韌皮部取食昆蟲—桃蚜（Myzus persicae）的繁殖。桃蚜取食擬南芥韌皮部后，能激活乙烯信號通路并且誘導韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的基因的表達，引發(fā)植物韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)(Phloem-based defenses，PBD)。PBD能夠抵御刺吸式昆蟲的取食。韌

2、皮部防衛(wèi)反應(yīng)包括韌皮部蛋白的積累、β-1，3-葡聚糖胼胝質(zhì)的生物合成、篩孔的縮小和篩板的增厚。
　　 本論文研究的主要目的是闡明在HrpNEa誘導擬南芥抗蟲過程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子并研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制;解析HrpNEa誘導抗蟲時啟動的韌皮部防衛(wèi)機制，尋找韌皮部防衛(wèi)通路中的作用因子，并研究各因子之間的調(diào)控關(guān)系。
　　 1.HrpNEa誘導擬南芥抗蟲過程中的轉(zhuǎn)錄因子篩選
　　 Harpin蛋白質(zhì)可以通過激活乙烯信號通路

3、進而誘導擬南芥的抗蟲作用。EIN2，是乙烯信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中有重要作用。為了研究HrpNEa在誘導擬南芥抗蟲中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，我們從擬南芥中挑選了乙烯或者昆蟲相關(guān)的37個的轉(zhuǎn)錄因子，分析這37種轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥抗蟲過程中的作用。RT-PCR方法顯示37種轉(zhuǎn)錄因子中22種轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因能被乙烯與HrpNEa誘導上調(diào)表達，6種下調(diào)表達，其余9種沒有變化。誘導上調(diào)表達基因中AtMYB44上調(diào)表達程度最強。根據(jù)對37

4、種轉(zhuǎn)錄因子突變體的蚜蟲繁殖率和趨避實驗結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)與野生型相比HrpNEa處理后9種突變體抗蟲能力較強，4種突變體較弱，24種突變體沒有顯著變化;所有突變體中atmyb44的抗蟲能力是最弱的。進一步的研究發(fā)現(xiàn)乙烯信號通路的標志基因PDF1.2在突變體atmyb44沒有表達，說明這個突變體中乙烯信號通路被阻斷，并且atmyb44中EIN2基因沒有被誘導表達。以上結(jié)果顯示AtMYB44在HrpNEa誘導擬南芥抗桃蚜的過程中有調(diào)控乙烯信號通

5、路的作用。
　　 2.AtGSL5與AtMYB44在HrpNEa誘導擬南芥抗蟲過程中的作用
　　 HrpNEa處理擬南芥后可以誘導AtMYB44的表達量增加，提高擬南芥對桃蚜的抗性。在植物受到韌皮部取食昆蟲如桃蚜的侵害時，部分葡聚糖合酶基因（GLUCANSYNTHASE-LIKE，GSL）及其作用產(chǎn)物β-1，3-葡聚糖胼胝質(zhì)起了重要作用。為了闡明GSL在HrpNEa誘導抗蟲中的作用，選用AtGSL1到AtGSL12這12

6、個葡聚糖合酶基因發(fā)生突變的37個atgsl突變體為材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在37個atgsl突變體的抗蟲性普遍比野生型差，其中atgsl5和atgsl6抗蟲能力最差。刺探電位圖譜技術(shù)(electrical penetrationgraph technique，EPG)的實驗結(jié)果表明在HrpNEa處理atgsl突變體后atgsl5的抗蟲能力是最弱的，這些結(jié)果都說明AtGSL5在HrpNEa誘導擬南芥抗蟲過程中的重要作用。除此之外，HrpNEa處理野

7、生型植株Clo-0后AtGSL5轉(zhuǎn)錄水平增強，胼胝質(zhì)的積累量增加，但處理突變體atgsl5后沒有發(fā)現(xiàn)上述的變化。我們還發(fā)現(xiàn)在突變體atgsl5和atmyb44中AtGSL5的表達量和胼胝質(zhì)的積累量都非常低。由此可知AtGSL5和AtMYB44在HrpNEa誘導擬南芥抗桃蚜過程中都起了重要作用。
　　 3.HrpNEa誘導擬南芥抗桃蚜過程中AtPP2-A1的作用
　　 HrpNEa能夠誘導擬南芥產(chǎn)生抗桃蚜等韌皮部取食昆蟲的

8、能力。當植物受到韌皮部取食昆蟲侵襲時，就會啟動韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)來抵御侵害。韌皮部蛋白(PP2)是植物韌皮部的重要組成部分之一。通過篩選我們發(fā)現(xiàn)擬南芥的30個AtPP2基因中AtPP2-A1的抗蟲作用顯著。因此，我們將目標放在研究PP2編碼基因AtPP2-A1在HrpNEa誘導植物抗蟲中的作用機制上。EPG(electrical penetration graph)技術(shù)和蚜蟲趨避實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HrpNEa能誘導擬南芥野生型WT(wild t

9、ype) Col-0產(chǎn)生抗蟲性，在AtPP2-A1突變體atpp2-al上卻不能誘導產(chǎn)生抗性。與突變體表現(xiàn)相反，AtPP2-A1過表達植株P(guān)P2OETAt(AtPP2-A1-overexpression transgenic Arabidopsis thaliana)表現(xiàn)出更強的抗性。我們對過表達植株P(guān)P2OETAt進行了AtPP2-A1定位的檢測，發(fā)現(xiàn)基因在植株的葉片、花與莖等器官上都有表達。在這些器官上觀察到PP2OETAt表現(xiàn)出比

10、野生型更強的抗蟲能力。這些結(jié)果說明AtPP2-A1在HrpNEa在誘導擬南芥產(chǎn)生抗蟲性中具有重要作用。
　　 4.AtMYB44通過EIN2調(diào)控擬南芥對于桃蚜與小菜蛾的抗性
　　 EIN2是乙烯信號通路中的重要調(diào)控因子，同時也在植物的抗蟲過程中起作用。擬南芥轉(zhuǎn)錄激活因子AtMYB44能夠調(diào)節(jié)EIN2的表達水平。為了研究AtMYB44對EIN2的調(diào)節(jié)作用與擬南芥抗蟲的關(guān)系，我們利用了多種植物材料，其中主要有:擬南芥野生型C

11、ol-0(wild type，WT)、突變體atmyb44、atmyb44的回補體（Complementedatmyb44，Catmyb44）、AtMYB44過表達植株(AtMYB44-Overexpression TransgenicArabidopsis)和MYB44OTA ein2-1(MYB44OTA與EIN2突變體ein2-1雜交產(chǎn)生)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtMYB44在擬南芥抗桃蚜和小菜蛾的過程中起重要作用。不論是MYB44OTA還是

12、蚜蟲誘導的Catmyb44都會導致植株體內(nèi)AtMYB44蛋白的表達量增加，而植株的抗性水平隨之增加。在MYB44OTA中AtMYB44與EIN2的結(jié)合能力要強于Catmyb44。但在MYB44OTA ein2-1中沒有發(fā)現(xiàn)AtMYB44與EIN2結(jié)合的情況。在上述的幾種植物材料中，只有過表達植株MYB44OTA，表現(xiàn)出持續(xù)的對于桃蚜等韌皮部取食昆蟲的抗性和體內(nèi)芥子油苷合成相關(guān)基因的大量表達。在MYB44OTA ein2-1與ein2-1