MYB44對(duì)HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗蟲防衛(wèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控作用.pdf

1、Harpins是由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的一種多效應(yīng)蛋白質(zhì)。其中HrpNEa研究比較透徹，早期實(shí)驗(yàn)表明外施HrpNEa能誘導(dǎo)植物包括抗蟲性在內(nèi)的多種抗性。研究發(fā)現(xiàn)HrpNEa誘導(dǎo)后能抑制擬南芥韌皮部取食昆蟲—桃蚜（Myzus persicae）的繁殖。桃蚜取食擬南芥韌皮部后，能激活乙烯信號(hào)通路并且誘導(dǎo)韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的基因的表達(dá)，引發(fā)植物韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)(Phloem-based defenses，PBD)。PBD能夠抵御刺吸式昆蟲的取食。韌

2、皮部防衛(wèi)反應(yīng)包括韌皮部蛋白的積累、β-1，3-葡聚糖胼胝質(zhì)的生物合成、篩孔的縮小和篩板的增厚。
　　 本論文研究的主要目的是闡明在HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗蟲過(guò)程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子并研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制;解析HrpNEa誘導(dǎo)抗蟲時(shí)啟動(dòng)的韌皮部防衛(wèi)機(jī)制，尋找韌皮部防衛(wèi)通路中的作用因子，并研究各因子之間的調(diào)控關(guān)系。
　　 1.HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗蟲過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄因子篩選
　　 Harpin蛋白質(zhì)可以通過(guò)激活乙烯信號(hào)通路

3、進(jìn)而誘導(dǎo)擬南芥的抗蟲作用。EIN2，是乙烯信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中有重要作用。為了研究HrpNEa在誘導(dǎo)擬南芥抗蟲中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，我們從擬南芥中挑選了乙烯或者昆蟲相關(guān)的37個(gè)的轉(zhuǎn)錄因子，分析這37種轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥抗蟲過(guò)程中的作用。RT-PCR方法顯示37種轉(zhuǎn)錄因子中22種轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因能被乙烯與HrpNEa誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，6種下調(diào)表達(dá)，其余9種沒(méi)有變化。誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)基因中AtMYB44上調(diào)表達(dá)程度最強(qiáng)。根據(jù)對(duì)37

4、種轉(zhuǎn)錄因子突變體的蚜蟲繁殖率和趨避實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)與野生型相比HrpNEa處理后9種突變體抗蟲能力較強(qiáng)，4種突變體較弱，24種突變體沒(méi)有顯著變化;所有突變體中atmyb44的抗蟲能力是最弱的。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)乙烯信號(hào)通路的標(biāo)志基因PDF1.2在突變體atmyb44沒(méi)有表達(dá)，說(shuō)明這個(gè)突變體中乙烯信號(hào)通路被阻斷，并且atmyb44中EIN2基因沒(méi)有被誘導(dǎo)表達(dá)。以上結(jié)果顯示AtMYB44在HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗桃蚜的過(guò)程中有調(diào)控乙烯信號(hào)通

5、路的作用。
　　 2.AtGSL5與AtMYB44在HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗蟲過(guò)程中的作用
　　 HrpNEa處理擬南芥后可以誘導(dǎo)AtMYB44的表達(dá)量增加，提高擬南芥對(duì)桃蚜的抗性。在植物受到韌皮部取食昆蟲如桃蚜的侵害時(shí)，部分葡聚糖合酶基因（GLUCANSYNTHASE-LIKE，GSL）及其作用產(chǎn)物β-1，3-葡聚糖胼胝質(zhì)起了重要作用。為了闡明GSL在HrpNEa誘導(dǎo)抗蟲中的作用，選用AtGSL1到AtGSL12這12

6、個(gè)葡聚糖合酶基因發(fā)生突變的37個(gè)atgsl突變體為材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在37個(gè)atgsl突變體的抗蟲性普遍比野生型差，其中atgsl5和atgsl6抗蟲能力最差。刺探電位圖譜技術(shù)(electrical penetrationgraph technique，EPG)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在HrpNEa處理atgsl突變體后atgsl5的抗蟲能力是最弱的，這些結(jié)果都說(shuō)明AtGSL5在HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗蟲過(guò)程中的重要作用。除此之外，HrpNEa處理野

7、生型植株Clo-0后AtGSL5轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng)，胼胝質(zhì)的積累量增加，但處理突變體atgsl5后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)上述的變化。我們還發(fā)現(xiàn)在突變體atgsl5和atmyb44中AtGSL5的表達(dá)量和胼胝質(zhì)的積累量都非常低。由此可知AtGSL5和AtMYB44在HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗桃蚜過(guò)程中都起了重要作用。
　　 3.HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗桃蚜過(guò)程中AtPP2-A1的作用
　　 HrpNEa能夠誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生抗桃蚜等韌皮部取食昆蟲的

8、能力。當(dāng)植物受到韌皮部取食昆蟲侵襲時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)來(lái)抵御侵害。韌皮部蛋白(PP2)是植物韌皮部的重要組成部分之一。通過(guò)篩選我們發(fā)現(xiàn)擬南芥的30個(gè)AtPP2基因中AtPP2-A1的抗蟲作用顯著。因此，我們將目標(biāo)放在研究PP2編碼基因AtPP2-A1在HrpNEa誘導(dǎo)植物抗蟲中的作用機(jī)制上。EPG(electrical penetration graph)技術(shù)和蚜蟲趨避實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HrpNEa能誘導(dǎo)擬南芥野生型WT(wild t

9、ype) Col-0產(chǎn)生抗蟲性，在AtPP2-A1突變體atpp2-al上卻不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性。與突變體表現(xiàn)相反，AtPP2-A1過(guò)表達(dá)植株P(guān)P2OETAt(AtPP2-A1-overexpression transgenic Arabidopsis thaliana)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性。我們對(duì)過(guò)表達(dá)植株P(guān)P2OETAt進(jìn)行了AtPP2-A1定位的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基因在植株的葉片、花與莖等器官上都有表達(dá)。在這些器官上觀察到PP2OETAt表現(xiàn)出比

10、野生型更強(qiáng)的抗蟲能力。這些結(jié)果說(shuō)明AtPP2-A1在HrpNEa在誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生抗蟲性中具有重要作用。
　　 4.AtMYB44通過(guò)EIN2調(diào)控?cái)M南芥對(duì)于桃蚜與小菜蛾的抗性
　　 EIN2是乙烯信號(hào)通路中的重要調(diào)控因子，同時(shí)也在植物的抗蟲過(guò)程中起作用。擬南芥轉(zhuǎn)錄激活因子AtMYB44能夠調(diào)節(jié)EIN2的表達(dá)水平。為了研究AtMYB44對(duì)EIN2的調(diào)節(jié)作用與擬南芥抗蟲的關(guān)系，我們利用了多種植物材料，其中主要有:擬南芥野生型C

11、ol-0(wild type，WT)、突變體atmyb44、atmyb44的回補(bǔ)體（Complementedatmyb44，Catmyb44）、AtMYB44過(guò)表達(dá)植株(AtMYB44-Overexpression TransgenicArabidopsis)和MYB44OTA ein2-1(MYB44OTA與EIN2突變體ein2-1雜交產(chǎn)生)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtMYB44在擬南芥抗桃蚜和小菜蛾的過(guò)程中起重要作用。不論是MYB44OTA還是

12、蚜蟲誘導(dǎo)的Catmyb44都會(huì)導(dǎo)致植株體內(nèi)AtMYB44蛋白的表達(dá)量增加，而植株的抗性水平隨之增加。在MYB44OTA中AtMYB44與EIN2的結(jié)合能力要強(qiáng)于Catmyb44。但在MYB44OTA ein2-1中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AtMYB44與EIN2結(jié)合的情況。在上述的幾種植物材料中，只有過(guò)表達(dá)植株MYB44OTA，表現(xiàn)出持續(xù)的對(duì)于桃蚜等韌皮部取食昆蟲的抗性和體內(nèi)芥子油苷合成相關(guān)基因的大量表達(dá)。在MYB44OTA ein2-1與ein2-1