嗜水氣單胞菌分離株毒力基因型分析及胞外蛋白酶的表達(dá)、提取和蛋白研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）廣泛存在于水環(huán)境中，對(duì)水生動(dòng)物、爬行類、兩棲類、鳥類及人類均可致病，是一種已引起廣泛重視的人畜共患病病原菌。本實(shí)驗(yàn)室通過抑制性差減雜交方法得到18個(gè)與致病性相關(guān)的基因片段，通過與其它致病菌株的序列進(jìn)行比對(duì)，選取3個(gè)胞外蛋白酶相關(guān)基因epr1、epr2、epr3和UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向異構(gòu)酶基因gneJ。設(shè)計(jì)并合成4對(duì)引物，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的63株嗜水氣單胞菌菌株進(jìn)行PC

2、R檢測(cè)，了解嗜水氣單胞菌不同分離株中這4個(gè)毒力基因片段的分布。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，可分為5個(gè)毒力基因型：epr1+epr2+epr3+gneJ+占47.6％（30/63）；epr1+epr2+epr3+gneJ-占15.9％（10/63）；epr1-epr2+epr3+gneJ-占11.1％（7/63）；epr1+epr2-epr3+gneJ-占9.5％（6/63）；epr1-epr2-epr3+gneJ-占15.8％（10/63），具備四種

3、毒力基因的菌株比例最高。
　　 本試驗(yàn)從每個(gè)毒力基因型中選取一株代表菌株，進(jìn)行了溶血性、溶蛋白活性、細(xì)胞毒性及小鼠半數(shù)致死量的研究。結(jié)果表明，epr1、epr2、gneJ均與嗜水氣單胞菌致病性相關(guān)，epr3在所檢測(cè)的菌株中都存在。不同毒力基因型的菌株在溶血性、溶蛋白性、細(xì)胞毒性及小鼠半數(shù)致死量方面存在明顯差異。以強(qiáng)毒株J-1為代表株的epr1+epr2+epr3+gneJ+為主要毒力基因型，溶血價(jià)為1:256，溶蛋白效價(jià)為1:5

4、12，細(xì)胞毒性半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）為10-6.54，小鼠半數(shù)致死量為4.12×105。隨毒力基因攜帶的減少，四種檢測(cè)指標(biāo)均有下降趨勢(shì)。
　　 根據(jù)Ah J-1中epr1、epr2、epr3的測(cè)序結(jié)果，在ORF內(nèi)設(shè)計(jì)編碼成熟蛋白的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物雙酶切后定向克隆于表達(dá)載體pET-32a（+）中，同時(shí)通過雙酶切將epr2，epr3在pET-32a（+）中進(jìn)行串聯(lián)。四個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli BL2

5、1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后epr1，epr2，epr3，epr2-3分別表達(dá)分子量為約36.4kDa、15.8kDa、38.2kDa和54kDa的蛋白。四個(gè)融合蛋白進(jìn)行溶蛋白活性檢測(cè)，epr1和epr2-3表達(dá)的蛋白均有明顯的溶蛋白圈。免疫轉(zhuǎn)印顯示Ah J-1全菌抗血清可以識(shí)別這兩個(gè)融合蛋白。純化的兩個(gè)表達(dá)蛋白分別免疫小鼠，三免后一周眼眶采血測(cè)抗體效價(jià)，待效價(jià)呈陽性，用50LD50（107CFU）的Ah J-1培養(yǎng)物，腹腔注射免疫后的小鼠，e

6、pr1、epr2-3的相對(duì)保護(hù)率分別為50％、60％。
　　 J-1培養(yǎng)上清經(jīng)硫酸銨沉淀，離子交換層析和分子篩層析后，可以獲得一種純化的蛋白，分子量約為38kDa，該蛋白具有溶蛋白活性。對(duì)其進(jìn)行二維電泳分析，觀察到單一分子量的蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜分析。根據(jù)結(jié)果，設(shè)計(jì)引物，在J-1中進(jìn)行編碼該蛋白基因的PCR擴(kuò)增并測(cè)序，結(jié)果與NCBI中基因序列比對(duì)，J-1中存在該段序列，編碼彈性蛋白酶（elastase）。其在細(xì)菌致病性中的作用和生物功能