嗜水氣單胞菌毒力特性研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是我國淡水養(yǎng)殖中常見的致病菌之一，常引起水生動物大面積爆發(fā)敗血癥。通常認(rèn)為這類細(xì)菌只有中等毒力，屬于條件性致病菌。致病菌的研究利用多以培養(yǎng)物方式保藏；培養(yǎng)物保藏過程不僅要求達(dá)到高存活率、無污染，還必須保持其特性的穩(wěn)定性，如形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性、遺傳特性以及細(xì)胞化學(xué)組成等；因此，細(xì)菌菌種的保藏具有非常重要的意義。但是目前情況下，人們很難控制細(xì)菌所有特性在傳代過程中不衰退或不

2、發(fā)生變異。引起細(xì)菌特性的改變?nèi)缍玖p弱，很大程度上，是與傳代過多或保藏方法不適等因素引致。雖然不能保證細(xì)菌在傳代過程中和保藏過程中完全不衰退或不變異，但我們可以通過改變某些因素使這種衰退或變異降到最低限度，使該菌種的主要特性在適宜的條件下保持相應(yīng)的穩(wěn)定。本論文通過對嗜水氣單胞菌的5種毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增，探討毒力基因分布與毒力的相關(guān)性；同時，對傳代和保藏前后的菌株分別進(jìn)行毒力基因的擴(kuò)增和毒力的測定，研究嗜水氣單胞菌在保藏過程中毒力減弱與毒力

3、基因分布之間的關(guān)系。并針對保藏過程中易導(dǎo)致毒力減弱的溫度和培養(yǎng)基兩個因素，其對毒力基因分布穩(wěn)定性的影響來對保藏過程中毒力減弱的機(jī)制進(jìn)行初探。
　　 試驗選取經(jīng)鑒定為嗜水氣單胞菌的21株菌株作為試驗對象，對嗜水氣單胞菌的5種主要毒力因子氣溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、絲氨酸蛋白酶(ahpA)、抗金屬蛋白酶(ast)、腸毒素(altA)設(shè)計5對特異性引物，用PCR方法進(jìn)行檢測，采用急性毒性試驗方法測定菌株對異育銀鯽(Cara

4、ssaisauratusgibebio)的半數(shù)致死量(50％lethaldose，LD50)，細(xì)菌藥物敏感試驗紙片擴(kuò)散(K-B)法檢測對抗生素的敏感性，結(jié)果顯示：除菌株Hong12的LD50約為109cfu，毒力弱外，其它菌株的毒力均較強(qiáng)，LD50均在106cfu左右。aerA、ahpA、hlyA、altA、ast五種毒力基因的攜帶率分別為77.8％、88.9％、100％、100％、88.9％。通過比較嗜水氣單胞菌毒力基因的分布情況與其

5、對異育銀鯽致病性試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，aerA、ahpA為嗜水氣單胞菌致病的主要毒力因子，與致病性存在相關(guān)性，ast與致病力也存在一定相關(guān)性，但不是主要毒力因子，hlyA、altA與致病性不存在相關(guān)性。21株嗜水氣單胞菌對青霉素、羧芐青霉素、萬古霉素不敏感，對復(fù)合磺胺、頭孢噻肟、利福平中毒敏感，對呋喃妥因、氯霉素、四環(huán)素、氧氟沙星高度敏感。
　　 為了了解試驗菌株毒力基因在傳代過程中的穩(wěn)定性，對傳代前后試驗菌株的毒力和毒力基因進(jìn)行測

6、定和檢測。采用急性毒性實驗方法測定10株嗜水氣單胞菌原代、第10代及第20代的菌株對異育銀鯽的半數(shù)致死量，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測原代、第10代及第20代的菌株中五種毒力基因aerA、hlyA、ahpA、altA、ast的變化情況。試驗結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌在傳代過程中毒力基因分布相對較穩(wěn)定，但是ahpA基因極易發(fā)生變異，在培養(yǎng)基上連續(xù)多次傳代后，毒力逐漸減弱乃至失去毒力?？赏浦琣hpA基因與毒力相關(guān)性最大，并易受傳代影響。<

7、br>　　 為了了解嗜水氣單胞菌毒力基因在保藏過程中的穩(wěn)定性，對保藏期間(3天、1周、2周、4周、8周、16周及32周)4株嗜水氣單胞菌的毒力和毒力基因進(jìn)行測定和檢測。采用急性毒性實驗方法分別測定5株嗜水氣單胞菌在各個保藏期的菌株對異育銀鯽的半數(shù)致死量，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測各個保藏期的菌株中五種毒力基因aerA、hlyA、ahpA、altA、ast的變化情況。試驗結(jié)果表明，不同保藏期單個毒力基因的變化經(jīng)分析可知各具特點，并

8、不具有一致的變化規(guī)律；但是具有一定的變化特點，即保藏一段時間后，菌株的毒力基因都會不同程度轉(zhuǎn)為陰性，這與毒力逐漸下降的趨勢相一致，毒力基因aerA、ahpA、ast的存在與毒力存在一定的相關(guān)性。
　　 同時，對保藏過程中易導(dǎo)致毒力發(fā)生變化的溫度和培養(yǎng)基兩個因素進(jìn)行試驗，探究其對毒力基因分布穩(wěn)定性的影響，選用溫度三水平(常溫、4℃、-20℃)、培養(yǎng)基三種(腦心浸脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基)作為保藏的因素，保藏一個月之后，采用