B亞型禽偏肺病毒檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、禽偏肺病毒(Avianmetapneumovirus，aMPV)于20世紀(jì)70年代末首次在南非報(bào)道，現(xiàn)已在許多國家都有分布。該病毒主要引起火雞和雞的上呼吸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如火雞鼻氣管炎(Turkeyrhinotracheitis，TRT)和肉雞的腫頭綜合征(Swollenheadsyndrome，SES)。根據(jù)對G蛋白核苷酸序列分析和單克隆抗體中和試驗(yàn)將禽偏肺病毒分為A、B、C、D四個(gè)亞型(JuhaszandEaston，1994

2、)。其中A亞型和B亞型禽偏肺病毒主要分布于歐洲和亞洲一些國家以及中東地區(qū)，C亞型和D亞型分別在美國和法國報(bào)道。
　　 我國于1999年首次分離并報(bào)道了該病毒，從而證實(shí)我國也有aMPV的流行。郭龍宗等2008年血清學(xué)調(diào)查顯示山東省部分地區(qū)肉種雞感染率可達(dá)100％。OwoadeA.A。等2008年采用RT-PCR的方法對我國南方部分省市的雞群進(jìn)行了檢測，結(jié)果A亞型陽性檢出率達(dá)到39％，B亞型為陰性。為了進(jìn)一步了解我國aMPV的流行情

3、況，本研究重點(diǎn)從診斷方法的建立方面進(jìn)行研究，從而為本病的防制提供理論依據(jù)。本研究內(nèi)容分為兩部分：
　　 一、B亞型禽偏肺病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立與應(yīng)用
　　 利用PrimerExplorerV4在線軟件設(shè)計(jì)了一套針對B亞型禽偏肺病毒F基因的特異性引物，并從反應(yīng)時(shí)間、溫度、各組分濃度等方面優(yōu)化了反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了B亞型禽偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-LAMP)快速檢測方法。該方法能夠在63℃條

4、件下1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)B亞型禽偏肺病毒F基因片段的特異性擴(kuò)增，與其他病毒，如H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)等的核酸無交叉反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果可直接用肉眼判斷。對質(zhì)粒DNA的最小檢測量為1×102copies/μL。利用建立的檢測方法對20份疑似禽偏肺病毒樣品進(jìn)行檢測，其陽性檢出率為10％。結(jié)果表明，建立的B亞型禽偏肺病毒RT-LAMP檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)

5、、靈敏度高的特點(diǎn)，可應(yīng)用于相關(guān)疾病的臨床診斷。
　　 二、B亞型禽偏肺病毒SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測方法的建立
　　 根據(jù)GenBank登錄的B亞型禽偏肺病毒(登錄號(hào)：JN224985.1)的F基因序列設(shè)計(jì)1對特異性引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出214bp的片段?；厥漳康钠尾⑴cpMD18-TVector連接后轉(zhuǎn)化到基因工程菌DH5α中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測序鑒定后，作為陽性模板建立SYBRGreenⅠ熒光