SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測(cè)J亞群禽白血病病毒方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、J亞群禽白血病((Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)是由J亞群禽白血病病毒引起的雞骨髓樣細(xì)胞瘤以及其它腫瘤性性疾病。1999年,我國(guó)首次由杜巖等在肉雞的商品代中分離了ALV-J。J亞群禽白血病在我國(guó)呈現(xiàn)了不斷發(fā)展的態(tài)勢(shì),宿主范圍已從肉用型雞向蛋雞和地方雞種蔓延,病雞的生產(chǎn)性能降低,死亡率明顯升高,給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,建立快速、特異和敏感的ALV-J檢測(cè)方法具有重要的實(shí)際意義。<

2、br>　　為建立SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)ALV-J的方法,本研究以ALV-J原型毒株HPRS-103基因組中pol基因3’端和gp85基因之間的保守區(qū)域作為檢測(cè)靶基因片段,構(gòu)建其重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)對(duì)模板濃度、引物濃度和退火溫度的優(yōu)化,建立了ALV-JSYBRGreenⅠ熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示該方法的最低檢測(cè)限度為2.36×103DNA分子/μL,較普通PCR提高100倍;可特異性擴(kuò)增出545bp的ALV-J

3、目的基因,而對(duì)其他禽源病毒無(wú)交叉反應(yīng);批內(nèi)變異系數(shù)為0.17~2.43％,批間變異系數(shù)2.73~3.68%,均小于5%。表明所建立的方法較高的靈敏性、很強(qiáng)的特異性、好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　根據(jù)所建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)臨床樣品和市售禽類疫苗進(jìn)行檢測(cè)。在所檢測(cè)的12種不同禽類疫苗中均未檢測(cè)到ALV-J,表明所檢測(cè)的市售禽類弱毒苗中無(wú)ALV-J污染。在所檢測(cè)的4個(gè)品種125只臨床疑似病雞中ALV-J陽(yáng)性檢出率為46.40%(

4、58/125),其中嶺南黃肉雞、淮南麻黃雞、地方雞種和京紅1號(hào)蛋雞的陽(yáng)性檢出率分別為65.31%(32/49)、55.26%(21/38)、31.25%(5/16)和0%(0/22),表明不同品種的雞對(duì)ALV-J的易感性不同。
　　選擇10只27周齡陽(yáng)性感染期嶺南黃肉雞,應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)不同臟器中ALV-J的分布及其mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中均能檢測(cè)到病毒基因,多重比較檢驗(yàn)分析顯示腎