2015年--（節(jié)選）醫(yī)學(xué)外文翻譯--脂滴結(jié)合蛋白通過(guò)分子蛋白介導(dǎo)的自噬降解幫助脂肪分解（譯文）

1、<p><b>　　中文7295字</b></p><p>　　出處：Kaushik S, Cuervo A M. Degradation of lipid droplet-associated proteins by chaperone-mediated autophagy facilitates lipolysis.[J]. Nature Cell Biology, 2015,

2、 17(6):759-770.</p><p>　　細(xì)胞與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)</p><p><b>　　文獻(xiàn)翻譯</b></p><p>　　文獻(xiàn)標(biāo)題：Degradation of lipid droplet-associated proteins by chaperone-mediated autophagy facilitates lipo

3、lysis </p><p>　　期刊來(lái)源： nature cell biology </p><p>　　選課代碼： MED130062.01 </p><p>　　姓名：

4、 </p><p>　　專業(yè)： 2013屆臨床醫(yī)學(xué) </p><p>　　學(xué)號(hào)： </p><p>　　班級(jí)：

5、 </p><p>　　脂滴結(jié)合蛋白通過(guò)分子蛋白介導(dǎo)的自噬降解幫助脂肪分解</p><p>　　Susmita Kaushik1,2 and Ana Maria Cuervo</p><p>　　分子蛋白介導(dǎo)的自噬（CMA）能夠選擇性地在溶酶體中降解胞漿蛋白的一個(gè)亞型。營(yíng)養(yǎng)剝奪能夠有效激發(fā)分子蛋白介導(dǎo)的自噬，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的甘油三酯或

6、脂滴也會(huì)水解（脂解）來(lái)產(chǎn)生自由脂肪酸來(lái)供能。在本文中，我們將介紹：脂滴結(jié)合蛋白perilipin 2(PLIN2) 和perilipin 3(PLIN3)是分子蛋白介導(dǎo)的自噬作用的底物，并且這兩種蛋白通過(guò)這一途徑進(jìn)行的降解發(fā)生在脂解之前?；铙w實(shí)驗(yàn)揭示了PLIN2和PLIN3通過(guò)分子蛋白介導(dǎo)的自噬途徑發(fā)生的降解在饑餓狀態(tài)增強(qiáng)，同時(shí)伴有脂肪組織甘油三酯水解酶和巨自噬蛋白對(duì)脂滴的高作用水平。分子蛋白介導(dǎo)的自噬。在培養(yǎng)的細(xì)胞或老鼠肝中阻斷分子蛋

7、白介導(dǎo)的自噬或抗CMA的PLIN蛋白的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致脂肪組織甘油三酯水解酶和脂自噬相關(guān)蛋白與脂滴的結(jié)合，繼而導(dǎo)致脂質(zhì)氧化的減少和脂滴的堆積。我們認(rèn)為分子蛋白介導(dǎo)的自噬對(duì)于脂滴生物學(xué)及對(duì)脂肪動(dòng)態(tài)平衡的維持有重要作用。</p><p>　　自噬作用通過(guò)在溶酶體內(nèi)降解蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞器維持了細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。失去作用的細(xì)胞器通過(guò)自噬而更新確保了質(zhì)量的控制，降解產(chǎn)物的再利用能為機(jī)體提供能量。在分子蛋白介導(dǎo)的自噬作用（后文均記

8、作CMA）中，熱休克蛋白70同源蛋白（hsc70）通過(guò)五肽模體識(shí)別蛋白并把蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)到溶酶體表面，與溶酶體相關(guān)膜蛋白2A（LAMP－2A;L2A）結(jié)合，這是CMA作用的限速步驟。L2A組裝成多聚體復(fù)合物，和溶酶體中的hsc70一同介導(dǎo)未折疊底物轉(zhuǎn)移到溶酶體中進(jìn)行降解。CMA在哺乳動(dòng)物大部分細(xì)胞中均存在，并且在長(zhǎng)時(shí)間饑餓、溫和的氧化脅迫、組織缺氧和脂肪合成后被最大程度地激活。溶酶體對(duì)LAMP-2A穩(wěn)定性的降低會(huì)導(dǎo)致衰老細(xì)胞器CMA活性的降低

9、。</p><p>　　除了已有良好定性的通過(guò)自噬的細(xì)胞更新，脂質(zhì)也可通過(guò)巨自噬進(jìn)行降解，通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入雙膜囊泡（自噬體）并與溶酶體融合。自噬介導(dǎo)的脂解選擇性地靶向脂質(zhì)，脂質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)作為能量?jī)?chǔ)備的脂肪儲(chǔ)存，能通過(guò)水解甘油三酯為游離脂肪酸來(lái)供能。脂滴被peripilin（PLIN）家族的結(jié)構(gòu)蛋白包圍，PLIN1主要存在與脂肪細(xì)胞，PLIN2和PLIN3在各種細(xì)胞中廣泛存在。脂解能夠在胞漿脂酶如ATGL的催化下進(jìn)行

10、，也能在溶酶體腔內(nèi)的脂酶作用下進(jìn)行，后者發(fā)生在自噬相關(guān)蛋白在脂滴表面裝配形成自噬體，吞噬部分脂滴并將其定位進(jìn)入溶酶體。</p><p>　　盡管CMA只能降解蛋白質(zhì)，不能降解脂肪，但肝臟CMA受到阻斷的老鼠表現(xiàn)出確定的脂肪變性，即使非選擇性的巨自噬功能完好。由于脂肪合成酶通過(guò)CMA降解減少而導(dǎo)致的分散的脂肪合成的增加不足夠解釋老鼠肝臟的大量脂肪堆積。這一發(fā)現(xiàn)，加上在諸如肝等組織，脂質(zhì)的大量涌入，脂解和CMA達(dá)到最

11、大速率激活發(fā)生在饑餓狀態(tài)；而CMA活性隨年齡增長(zhǎng)而降低，常伴隨發(fā)生細(xì)胞內(nèi)的脂堆積，促使我們來(lái)進(jìn)一步研究CMA在調(diào)控脂肪動(dòng)態(tài)平衡中的作用。</p><p>　　本文中，我們展示了在細(xì)胞內(nèi)和老鼠肝，CMA的阻斷均會(huì)減少脂滴的溶解。在增強(qiáng)脂解的條件下，CMA降解脂滴相關(guān)蛋白PLIN2和PLIN3，這還有助于脂滴結(jié)合胞漿脂肪酶ATGL及巨自噬相關(guān)蛋白ATG。減少的CMA會(huì)阻礙脂肪分解所需物質(zhì)的補(bǔ)充，因此我們認(rèn)為CMA對(duì)脂

12、滴巨自噬和胞漿脂解是重要的上游調(diào)控。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　LAMP-2A缺陷細(xì)胞出現(xiàn)脂滴堆積現(xiàn)象</p><p>　　我們使用了在肝細(xì)胞中敲除LAMP-2A（L2AKO）的老鼠肝臟和敲除了L2A的老鼠成纖維細(xì)胞（L2A(-)）來(lái)阻斷CMA。借此我們證實(shí)了，盡管和肝細(xì)胞相比，成纖維細(xì)胞對(duì)脂肪代謝的需求很小

13、，L2A缺乏的成纖維細(xì)胞比對(duì)照組顯著地有更多甘油三酯堆積。當(dāng)我們?cè)谂囵B(yǎng)基中減少葡萄糖或給予脂肪生成的刺激（OL）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)對(duì)脂肪的利用被刺激，甘油三酯水平的差異更顯著。</p><p>　　與對(duì)照組相比，我們?cè)贚2AKO組老鼠的L2A敲除細(xì)胞僅發(fā)現(xiàn)了微小的甘油三酯合成增加的趨勢(shì)。與之相反，L2A(-)細(xì)胞表現(xiàn)出有顯著差異的β氧化速率的降低，這是甘油三酯水解的下游反應(yīng)，基態(tài)或脂肪生成的條件下均如此；此外，L2A(-

14、)細(xì)胞無(wú)法在OL暴露下加快氧消耗的速率（OCR）。L2A(-)細(xì)胞降低的β氧化速率本質(zhì)上不是由于線粒體缺陷，因?yàn)榫哂型旰玫哪る娢坏木€粒體百分?jǐn)?shù)以及線粒體更新和CTR細(xì)胞是相似的。對(duì)照組和L2A(-)細(xì)胞β氧化速率的差異在乙莫克害存在下顯著減少，這暗示出現(xiàn)脂滴堆積在本質(zhì)上是由于脂肪動(dòng)員出現(xiàn)問(wèn)題，而非氧化步驟的問(wèn)題。</p><p>　　與L2AKO老鼠顯著的脂肪肝現(xiàn)象一致的是，L2A(-)成纖維細(xì)胞堆積更多、更大的

15、脂滴，在正常條件或OL暴露條件下均如此。與對(duì)照組不同，加入乙莫克害的L2A(-)細(xì)胞無(wú)法增加脂滴，支持了脂肪動(dòng)員缺陷的猜測(cè)。為了進(jìn)一步檢測(cè)這一假說(shuō)，我們使用不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的脂解。OL刺激的對(duì)照組細(xì)胞，在移除OL時(shí)表現(xiàn)出脂滴數(shù)量和體積的減少，而在無(wú)血清培養(yǎng)皿中則更顯著。反之，OL刺激的L2A(-)細(xì)胞則始終保持脂滴數(shù)目和體積的增加。相似地，為了幫助細(xì)胞利用儲(chǔ)存脂質(zhì)，我們?cè)诘吞腔驘o(wú)血清培養(yǎng)基里培養(yǎng)細(xì)胞，展現(xiàn)出了L2A(-)細(xì)

16、胞降低甘油三酯水平及脂滴容量能力的顯著降低。電鏡下觀察證實(shí)了在CMA缺陷細(xì)胞中，脂滴數(shù)目、平均體積以及所占細(xì)胞空間都高于對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)所有條件下均如此。L2A(-)細(xì)胞中的脂滴堆積是L2A喪失的直接后果，因?yàn)長(zhǎng)2A在這些細(xì)胞中的表達(dá)就對(duì)照組細(xì)胞水平而言足夠減少脂滴。綜上所訴，這些結(jié)果表面，CMA的阻斷會(huì)導(dǎo)致脂滴堆積，并且這主要是脂滴無(wú)法正常減少的后果。</p><p>　　脂滴蛋白PLIN2和PLIN3是CMA作

17、用的底物</p><p>　　由于只有蛋白質(zhì)可以作為CMA的底物，脂質(zhì)不可以，我們接下來(lái)研究了CMA對(duì)于脂滴蛋白質(zhì)降解的作用，這將能解釋在CMA阻斷細(xì)胞中脂滴利用缺陷的原因。對(duì)PLIN2和PLIN3蛋白進(jìn)行免疫印記法和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，L2A(-)細(xì)胞在基態(tài)條件、OL刺激和后期OL刺激條件下都表現(xiàn)出顯著的更高水平的蛋白表達(dá)。與已知的PLIN2蛋白通過(guò)泛素蛋白酶體通路的更新相一致，對(duì)照組細(xì)胞中蛋白酶體抑制劑增加了脂滴數(shù)

18、量和PLIN2水平，但在CMA阻斷細(xì)胞中沒(méi)有出現(xiàn)這一現(xiàn)象，盡管蛋白酶體對(duì)泛素化蛋白和降解決定因子－GFP的降解速率是正常的。我們對(duì)比了脂滴在蛋白酶體或溶酶體被抑制后發(fā)生的堆積情況，發(fā)現(xiàn)了一種可能性：PLIN蛋白也能被溶酶體降解。</p><p>　　為了驗(yàn)證CMA對(duì)PLIN2、PLIN3降解的可能的作用，我們首先探究了它們與溶酶體的聯(lián)系。能夠支持PLIN蛋白經(jīng)溶酶體作用更新的一個(gè)現(xiàn)象是，在對(duì)照組細(xì)胞用氯化銨及亮抑

19、酶肽抑制溶酶體途徑降解顯著增加了PLIN2或PLIN3與溶酶體標(biāo)記物的共定位，在OL刺激條件下這一增加更顯著。相反的，L2A(-)細(xì)胞表現(xiàn)出PLIN2及PLIN3與溶酶體的結(jié)合減少以及溶酶體抑制劑不穩(wěn)定狀態(tài)的修復(fù)。與CMA反應(yīng)不活躍的細(xì)胞相比，CMA活躍的細(xì)胞中PLIN2和PLIN3在溶酶體中的含量更高。L2A(-)細(xì)胞中，PLIN2和PLIN3在溶酶體內(nèi)的含量都降低。我們證實(shí)了在活體內(nèi)溶酶體與PLIN2/3的結(jié)合會(huì)引發(fā)它們的降解，因?yàn)?/p>

20、用亮抑酶肽阻斷饑餓狀態(tài)老鼠溶酶體蛋白質(zhì)水解2小時(shí)，足夠增加CMA活躍的細(xì)胞中脂滴蛋白在溶酶體中的含量。PLIN2的CMA途徑降解在飼養(yǎng)充足的老鼠細(xì)胞內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)，雖然比饑餓狀態(tài)老鼠降解的程度低；而PLIN3通過(guò)溶酶體的降解在飽食動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的程度可以忽略不計(jì)。我們發(fā)現(xiàn)PLIN蛋白在CMA阻斷細(xì)胞的溶酶體中也存在一些降解，可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)脂巨自噬進(jìn)行的降解，因?yàn)檫@些溶酶體優(yōu)先與自噬體結(jié)合。綜上所述</p><p>　　

21、PLIN蛋白和分子伴侶hsc70互相影響進(jìn)行CMA</p><p>　　CMA反應(yīng)的第一步就是底物與hsc70相互作用，為接下來(lái)的溶酶體定位做準(zhǔn)備。當(dāng)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟的脂解作用活躍時(shí)，PLIN2和PLIN3含量降低的同時(shí)，我們還在分離出的老鼠肝臟脂滴中發(fā)現(xiàn)了hsc70，并且含量隨著饑餓狀態(tài)持續(xù)而增長(zhǎng)。免疫熒光檢測(cè)法證實(shí)了在脂滴中，hsc70和每個(gè)PLIN蛋白都是共同定位的，并隨著OL刺激而加強(qiáng)（OL刺激能夠誘發(fā)脂解）

22、。在OL刺激后把細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)誘發(fā)脂動(dòng)員，這會(huì)減弱hsc70與脂滴的結(jié)合。明顯地，L2A(-)細(xì)胞中，hsc70在所有條件下都與脂滴中的PLIN2或PLIN3有更好的共定位。同樣地，L2AKO組老鼠肝中分離出的脂滴中也發(fā)現(xiàn)比對(duì)照組更高含量的hsc70。</p><p>　　我們?cè)谂囵B(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了hsc70與PLIN2或PLIN3直接的相互作用。我們?cè)谡郫B式PLIN2和3中發(fā)現(xiàn)了Hsc70，同樣也在折疊式

23、hsc70中找到來(lái)PLIN蛋白。折疊相同量的PLIN，我們發(fā)現(xiàn)在L2A(-)細(xì)胞中有更多的被結(jié)合的hsc70。當(dāng)細(xì)胞中的CMA由于溶酶體受體被敲除而阻斷，但hsc70與底物的識(shí)別還完好時(shí)，底物與hsc70的結(jié)合會(huì)特征性地增加。這種增加的、hsc70和多個(gè)底物的結(jié)合解釋了為何未在hsc70折疊中發(fā)現(xiàn)更高水平的PLIN蛋白。當(dāng)對(duì)L2A(-)細(xì)胞施以更高濃度的OL刺激來(lái)提高CMA活性時(shí)，hsc70與PLIN2或PLIN3結(jié)合的程度大大提高，而

24、在對(duì)照組細(xì)胞中，它們的結(jié)合水平保持不變，支持了LD蛋白通過(guò)CMA而不斷更新的猜想。PLIN2和脂滴的結(jié)合位點(diǎn)幾乎是專一的，與之相反的是，PLIN3在細(xì)胞的其他區(qū)室也存在。我們分離出老鼠肝臟的脂滴并證實(shí)有hsc70和PLIN蛋白的相互作用的發(fā)生。這些結(jié)果與PLIN和分子伴侶hsc70在脂滴表面被識(shí)別、而后進(jìn)行CMA介導(dǎo)的降解的理論是相協(xié)調(diào)的。</p><p>　　CMA靶向的PLIN蛋白的修飾</p>

25、<p>　　為了進(jìn)一步證實(shí)CMA參與OLIN更新，我們使用了非典型的維甲酸衍生物來(lái)激活OL刺激細(xì)胞的CMA途徑?；瘜W(xué)激活CMA顯著減少了對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)PLIN蛋白和脂滴的含量，但L2A(-)細(xì)胞卻非如此，事實(shí)上，通過(guò)瞬間的轉(zhuǎn)染來(lái)恢復(fù)L2A(-)細(xì)胞內(nèi)的L2A水平已經(jīng)足夠使得細(xì)胞內(nèi)的PLIN蛋白水平達(dá)到與對(duì)照組相近的值。</p><p>　　為了識(shí)別出出發(fā)PLIN進(jìn)行CMA降解的可能的翻譯后修飾，我們采取

26、了二維電泳療法和免疫印記法并發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)十分突出的PLIN2的形式，等電點(diǎn)分別為5.6和5.9，還有一種較少量的異構(gòu)體，等電點(diǎn)為5.3。當(dāng)OL刺激誘發(fā)脂解和后續(xù)的PLIN2降解，含量較少的異構(gòu)體在對(duì)照組細(xì)胞中不再存在，但在L2A(-)細(xì)胞依然存在。用磷酸酶處理細(xì)胞證明了對(duì)照組細(xì)胞中，PLIN2在脂解過(guò)程中被磷酸化修飾，但在L2A(-)細(xì)胞中未被磷酸化修飾，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的PLIN2在磷酸酶的作用下不反應(yīng)。使用phos－tag來(lái)電泳分析脂滴證實(shí)

27、來(lái)在對(duì)照組細(xì)胞中存在PLIN2的一種被磷酸化的形式，但在L2A(-)細(xì)胞中幾乎不存在。盡管要闡明為什么CMA功能確實(shí)的細(xì)胞中磷酸化修飾的PLIN2含量低還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，但我們的研究表明了PLIN2的磷酸化可能是觸發(fā)CMA降解所必需的。</p><p>　　抗CMA途徑的PLIN2導(dǎo)致脂肪變性</p><p>　　Hsc70通過(guò)一個(gè)五肽模體結(jié)合CMA底物。PLIN3具有一個(gè)典型的CMA模體

28、（100LDRLQ）而PLIN2具有一個(gè)推斷的模體（414SLKVQ）。為了排除其它CMA阻斷帶來(lái)的變化而單獨(dú)分析阻礙PLIN2降解的后果，我們使PLIN2的CMA靶向位點(diǎn)414SLKVQ發(fā)生突變。對(duì)照組細(xì)胞中野生型PLIN2和CMA突變的PLIN2-GFP導(dǎo)致了更高含量的CMA突變PLIN2-GFP，脂滴含量和體積比表達(dá)野生型PLIN2的細(xì)胞增加了多至2.7倍，在正常條件和OL刺激下均是如此。突變型PLIN2-GTP的堆積主要是由于溶

29、酶體降解的減少，證據(jù)是加入溶酶體抑制劑使得野生型PLIN2增加，但突變型PLIN2-GFP含量不增加；此外，與野生型PLIN2不同，加入溶酶體抑制劑也無(wú)法增加突變型PLIN2與溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1的共定位。</p><p>　　我們證實(shí)了破壞PLIN2的CMA靶向作用模體幾乎完全消除了PLIN2與hsc70的結(jié)合，解釋了為何在表達(dá)突變型PLIN2細(xì)胞內(nèi)hsc70與脂滴的共定位會(huì)減少。脂滴中突變型PLIN2的留存

30、改變了它們的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)以及與溶酶體的相互作用。因此，同時(shí)表達(dá)野生型和突變型PLIN2的細(xì)胞的活細(xì)胞成像圖像揭示出野生型PLIN2-GFP脂滴主要是很小且易于移動(dòng)的，此外還表現(xiàn)出脂滴間動(dòng)態(tài)的結(jié)合以及脂滴與溶酶體間的kiss-and-run型內(nèi)吞。于此形成明顯反差的是，表達(dá)突變型PLIN2的細(xì)胞中的大部分脂滴都變得更大，聚集成群而活性下降，而極少數(shù)的較小的脂滴也幾乎不與溶酶體結(jié)合?？偠灾璧KPLIN2通過(guò)CMA的降解足夠誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的脂堆

31、積并減少脂滴與溶酶體的相互作用。</p><p>　　PLIN的CMA途徑缺失會(huì)阻礙脂解</p><p>　　脂滴中的甘油三酯在胞漿脂肪酶或溶酶體脂肪酶的作用下會(huì)分解成自由脂肪酸，其中，溶酶體脂肪酶通過(guò)脂滴巨自噬與之結(jié)合。為了檢測(cè)哪一種脂解通路無(wú)法在L2A(-)細(xì)胞啟動(dòng)脂肪動(dòng)員，我們用脂肪酶抑制劑——甲基傘形酮磷酸酯和溶酶體抑制劑（NL）一起處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞的β氧化減弱，但L2A細(xì)

32、胞維持無(wú)反應(yīng)。統(tǒng)觀這些發(fā)現(xiàn)，表明了阻礙CMA會(huì)損害通過(guò)磷酸酶或脂滴巨自噬進(jìn)行的脂解。</p><p>　　ATGL是大部分類型細(xì)胞的胞漿限速脂解酶，它在刺激脂肪生成的條件下和脂滴共定位來(lái)誘發(fā)脂肪分解。相似地，化學(xué)激活CMA會(huì)增加ATGL與脂滴的共定位。相反地，CMA缺陷的細(xì)胞在所有的情況下都表現(xiàn)出ATGL與脂滴結(jié)合的顯著的降低，盡總體上ATGL的含量并未改變，表明了這種脂肪酶無(wú)法與脂滴結(jié)合。在CMA阻斷細(xì)胞中，A

33、TGL脂肪分解酶活性的降低不能歸咎于它與內(nèi)源的調(diào)節(jié)器的結(jié)合的改變，因?yàn)椋谙喾吹那闆r中，在L2A(-)細(xì)胞中抑制ATGL后表現(xiàn)出它與其抑制劑G0/G1開(kāi)關(guān)基因的結(jié)合的減少，并增強(qiáng)它與其共激活基因的結(jié)合，可能反映了細(xì)胞對(duì)于支持脂解的補(bǔ)償效應(yīng)?；铙w內(nèi)相似的變化發(fā)生，當(dāng)老鼠處于饑餓狀態(tài)時(shí)，ATGL和老鼠肝脂滴的結(jié)合增強(qiáng)，饑餓狀態(tài)既會(huì)激活脂解，也會(huì)激活CMA，但L2AKO大鼠肝中分離出的脂滴表現(xiàn)出一種不相關(guān)卻一貫的ATGL含量降低，以及它的共激

34、活基因CGI-58的顯著降低。此外，抗CMA途徑的PLIN2——而非野生型PLIN2的表達(dá)，足夠使ATGL和脂滴的結(jié)合顯著降低。因此，在CMA阻斷細(xì)胞中，無(wú)法將PLIN2從脂滴移除導(dǎo)致了脂解的減少，部分原因是胞漿脂肪酶ATGL和脂滴的結(jié)合被損壞。</p><p>　　為了研究在CMA阻斷細(xì)胞中，依賴溶酶體的噬脂活動(dòng)降低的原因，我們首先分析了巨自噬阻斷時(shí)，脂滴數(shù)量的改變。3-甲腺嘌呤的增加能夠減少對(duì)照組和L2A(-

35、)細(xì)胞的巨自噬，但僅在對(duì)照組細(xì)胞中增加了脂滴數(shù)量。相似地，用納巴霉素上調(diào)細(xì)胞的巨自噬，使得對(duì)照組細(xì)胞表現(xiàn)出比L2A(-)細(xì)胞更顯著的脂滴含量減少。CMA缺陷細(xì)胞內(nèi)體現(xiàn)出的這些脂滴巨自噬的減少，與之前所報(bào)道的這些細(xì)胞中的無(wú)選擇性的巨自噬的增加形成鮮明對(duì)比，這一現(xiàn)象我們?cè)贚C3著色實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了確實(shí)。為了探究脂滴無(wú)法進(jìn)行巨自噬的原因，我們對(duì)肝臟細(xì)胞的脂解作用在長(zhǎng)期饑餓后被激活情況下，以及OL刺激下的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了巨自噬蛋白對(duì)脂滴作用增強(qiáng)的分

36、析。對(duì)L2A(-)細(xì)胞進(jìn)行共免疫染色發(fā)現(xiàn)，脂滴與巨自噬起始化合物組分、自噬體延長(zhǎng)所需蛋白（ATG5）以及自噬體結(jié)構(gòu)成分的共定位顯著降低。我們還分析了兩種貨物識(shí)別蛋白，發(fā)現(xiàn)L2A(-)細(xì)胞中的脂滴與NBR1的共定位較弱，而在通常情況下兩者的共定位在脂解過(guò)程中是增加的，而脂滴與p62的共定位則與正常情況下相同，保持不變。脂滴與ATG7——介導(dǎo)自噬體延長(zhǎng)的連接酶的共定位保持不變，而其它ATG蛋白比如ULK1，ATG</p>&l

37、t;p>　　總而言之，我們提出，通過(guò)CMA降解脂滴結(jié)合蛋白PLIN2和PLIN3是脂滴與胞漿脂肪酶和巨自噬效應(yīng)蛋白結(jié)合都需要的，而隨后發(fā)生的脂解反應(yīng)解釋了CMA損壞細(xì)胞內(nèi)觀察到的脂肪堆積。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　本文中，我們展示了CMA在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)降解脂滴蛋白PLIN2和PLIN3來(lái)調(diào)控脂肪動(dòng)員的作用。除去這些脂滴蛋白是后

38、續(xù)脂解發(fā)生的先決條件，因?yàn)槿绻麩o(wú)法通過(guò)CMA除去這些蛋白會(huì)減少脂滴與胞漿脂肪酶和脂滴巨自噬相關(guān)蛋白的結(jié)合。</p><p>　　脂滴中的甘油三酯被胞漿脂肪酶分解產(chǎn)生自由脂肪酸，在線粒體進(jìn)行β氧化，或通過(guò)巨自噬的途徑被溶酶體脂肪酶降解。ATG和ATG陽(yáng)性細(xì)胞膜在脂解過(guò)程中可在脂滴中檢測(cè)到，暗示自噬體限制在脂滴表面形成膜。事實(shí)上，近期的研究表明脂滴是自噬體生源論的一個(gè)位點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)在自噬體選擇性地隔離脂滴前需要CMA

39、反應(yīng)，表明為了使ATG和自噬體結(jié)合并啟動(dòng)自噬反應(yīng)，脂滴周圍的蛋白需要被從脂滴表明除去。因此，可以將大部分巨自噬歸因于在CMA阻斷細(xì)胞中觀察到的唯一剩下的脂肪酶，在這些細(xì)胞中含量上調(diào)，并且不需要貨物識(shí)別過(guò)程。胞漿脂解受到PLIN蛋白與脂肪酶之間復(fù)雜的互相作用的調(diào)控。ATGL和脂滴在最大脂肪分解的情況下結(jié)合脂滴，而脂滴表明的PLIN發(fā)揮一種屏蔽作用，調(diào)節(jié)甘油三酯與脂肪酶之間的接觸。如此看來(lái)，PLIN的過(guò)表達(dá)會(huì)降低脂滴與ATGL的結(jié)合，并因此

40、降低脂解作用。我們認(rèn)為，CMA通過(guò)從脂滴表面除去PLIN幫助脂解，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞中PLIN含量升高時(shí)，ATGL與脂滴的結(jié)合減少，因?yàn)槭軗p的CMA或CMA突變基因的表達(dá)。此外，除去PLIN還能幫助共激活劑與已經(jīng)連接于脂滴的ATGL結(jié)合，因?yàn)樽钄郈MA會(huì)降低脂滴中CGI-</p><p>　　盡管PLIN已經(jīng)被報(bào)道為一種蛋白酶體的底物，溶酶體和蛋白酶體都能降解相同的蛋白質(zhì)，這取決于細(xì)胞的需求或細(xì)胞類型，PLIN1

41、即是如此。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)溶酶體和蛋白酶體都能降解PLIN2，但有趣的是，阻斷CMA也會(huì)阻礙PLIN2通過(guò)蛋白酶體途徑的降解。盡管看起來(lái)CMA可能真的能非直接地幫助蛋白酶體降解PLIN2，但我們的數(shù)據(jù)并不支持這一看法，因?yàn)镻LIN2直接和hsc70相互作用；我們?cè)贑MA活躍地溶酶體中檢測(cè)到PLIN2及其降解；而清除CMA靶向模體使得脂滴中地PLIN2保留下來(lái)。我們因此提出，PLIN2由hsc70直接識(shí)別，并靶向CMA降解。蛋白酶

42、體可能只能在PLIN降解已經(jīng)被CMA引發(fā)起始后才能與其結(jié)合作用，或者PLIN2受蛋白酶體的降解能夠定位在不同的區(qū)室，正如前文所描述的那樣。</p><p>　　我們認(rèn)為PLIN2和PLIN3——最先的脂質(zhì)錨定蛋白是CMA作用的底物。脂滴中hsc70的出現(xiàn)，以及當(dāng)CMA阻斷時(shí)它在脂滴表面持續(xù)存在，加上在這些情況下脂滴與溶酶體活性的改變，共同表明脂滴表面存在微環(huán)境，在這個(gè)微環(huán)境中，脂滴和溶酶體十分鄰近。和我們?cè)谇拔奶?/p>

43、到的脂滴與溶酶體的相互作用相似，還存在脂滴與其它細(xì)胞器間不斷變化的、短暫的相互作用，比如與線粒體和過(guò)氧化物酶體，功能是把游離脂肪酸從脂肪分解位點(diǎn)引導(dǎo)到氧化位點(diǎn)。我們使用顯微鏡對(duì)活細(xì)胞的的觀察支持脂滴與溶酶體的kiss-and-run模型事件在PLIN通過(guò)CMA降解途徑受損害的時(shí)候會(huì)顯著降低，比如PLIN2的CMA靶向模體突變，使得hsc70與其的相互作用受到阻礙時(shí)。</p><p>　　因此我們提出，通過(guò)CMA的

44、PLIN降解發(fā)生在脂滴的分離部位，來(lái)協(xié)助準(zhǔn)時(shí)從脂滴表面除去PLIN，讓ATGL和ATG能夠接觸到儲(chǔ)存的甘油三酯。ATGL快速、循環(huán)地與脂滴結(jié)合再脫離，來(lái)促進(jìn)脂解，相似地，LC3與脂滴的結(jié)合是極化的，發(fā)生在脂滴表面分離的、限速膜開(kāi)始形成的區(qū)域。盡管決定在脂滴的特定區(qū)域除去僅僅一部分的PLIN的機(jī)制還需要更多研究，我們推測(cè)PLIN磷酸化的改變可能幫助了PLIN的特定部分從脂滴中釋放出來(lái)。事實(shí)上，PLIN2已經(jīng)被認(rèn)為是脂滴磷酸化蛋白質(zhì)組的一部

45、分。</p><p>　　我們提出，在L2AKO組老鼠肝臟中觀察到的脂堆積，是由一系列原因共同導(dǎo)致的，包括：通過(guò)CMA降解的脂肪生成酶含量的增加、VLDL分泌的減少，以及由于當(dāng)PLIN未經(jīng)CMA降解，胞漿脂肪酶和ATG無(wú)法與脂滴結(jié)合而引起的脂肪分解的減少。我們先前已經(jīng)展示了長(zhǎng)期的脂質(zhì)負(fù)載會(huì)抑制CMA活性。根據(jù)我們現(xiàn)在關(guān)于儲(chǔ)存脂質(zhì)通過(guò)CMA的調(diào)控的發(fā)現(xiàn)，能夠相信CMA的損害會(huì)引起脂滴在細(xì)胞中過(guò)度負(fù)載的惡循環(huán)。CMA