脂聯(lián)素通過(guò)AMPK-ULK1介導(dǎo)自噬調(diào)控膿毒癥炎癥反應(yīng)的研究.pdf

1、本文通過(guò)以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 脂聯(lián)素對(duì)膿毒癥小鼠炎性反應(yīng)及自噬水平的影響
　　目的:
　　探討脂聯(lián)素對(duì)膿毒癥小鼠炎性反應(yīng)及自噬水平的影響及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　清潔級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠32只，體重20～25 g，2月齡，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組(n=8):假手術(shù)組（C組）、膿毒癥模型組(CLP組)、外源性脂聯(lián)素組(APN組)和膿毒癥模型+外源性脂聯(lián)素組（CLP/APN組）。C

2、LP組及CLP/APN組采用盲腸結(jié)扎穿孔法構(gòu)建膿毒癥動(dòng)物模型;CLP/APN組于CLP術(shù)前12h經(jīng)腹腔注射基因重組脂聯(lián)素6 mg/kg; APN組于CLP/APN組相同時(shí)刻經(jīng)腹腔注射基因重組脂聯(lián)素6 mg/kg。密切觀察小鼠直至造模后24h時(shí)，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，斷頭法處死小鼠并留取肝、肺組織標(biāo)本。HE染色切片觀察小鼠肝、肺組織損傷;Elisa法檢測(cè)小鼠血清IL-1β及IL-6水平;免疫熒光染色觀察小鼠肝、肺組織LC3B含量。
　

3、　結(jié)果:
　　1.與C組比較，CLP組和CLP/APN組小鼠肝、肺組織損傷明顯加重;小鼠血清IL-1β及IL-6水平增高(P＜0.05);免疫熒光染色示LC3B顆粒面積增加(P＜0.05)。
　　2.與CLP組比較，CLP/APN組小鼠肝、肺組織損傷明顯得到改善;小鼠血清IL-Iβ及IL-6水平降低(P＜0.05);免疫熒光染色示LC3B顆粒面積進(jìn)一步增加(P＜0.05)。
　　3.C組與APN組小鼠肝、肺組織損傷未見(jiàn)

4、明顯差異;小鼠血清IL-1β及IL-6水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);免疫熒光染色示LC3B顆粒面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　脂聯(lián)素可顯著改善膿毒癥小鼠肝、肺組織病理?yè)p傷，降低小鼠血清IL-1β及IL-6水平，同時(shí)提高膿毒癥小鼠肝、肺組織自噬水平。
　　第二部分 脂聯(lián)素通過(guò)AMPK/ULK1介導(dǎo)自噬調(diào)控LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎性水平的研究
　　目的:
　　探討脂

5、聯(lián)素是否通過(guò)AMPK/ULK1通路介導(dǎo)自噬調(diào)控LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)。
　　方法:
　　1.收集清潔級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。
　　2.探討自噬抑制劑對(duì)脂聯(lián)素預(yù)處理LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響。設(shè)置分組:對(duì)照組（C組）;LPS干預(yù)組（LPS組）;脂聯(lián)素組（APN組）;LPS+脂聯(lián)素組(LA組);LPS+自噬抑制劑3-MA組(L3組);LPS+脂聯(lián)素+3-MA組（LA3

6、組）。
　　3.探討ULK1在脂聯(lián)素調(diào)控自噬信號(hào)通路中的作用。設(shè)置分組:對(duì)照組(S組);LPS干預(yù)組（LPS組）;脂聯(lián)素組(APN組);LPS+脂聯(lián)素組（LA組）;LPS+ULK1抑制劑SBI-0206965組(LS組);LPS+旨聯(lián)素+SBI-0206965組(LAS組)。
　　4.探討脂聯(lián)素是否通過(guò)AMPK調(diào)控自噬水平抑制炎癥反應(yīng)。設(shè)置分組:對(duì)照組（C組）;LPS干預(yù)組（LPS組）;脂聯(lián)素組（APN組）; LPS+脂聯(lián)素

7、組(LA組);LPS+ AMPK抑制劑Compound C組（LC組）;LPS+脂聯(lián)素+ AMPK抑制劑Compound C組（LAC組）。
　　5.上述子問(wèn)題中，采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IL-1β及IL-6水平;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組活性氧水平;采用Western Blot檢測(cè)各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、AMPK、ULK1水平。
　　結(jié)果:
　　1.與C組比較，LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞16

8、h后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β及IL-6水平增加，ROS水平升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平增加，AMPK水平增加(P＜0.05)。
　　2.與LPS組比較，LA組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β及IL-6水平降低，ROS水平降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平進(jìn)一步增加，ULK1、AMPK水平增加(P＜0.05)。
　　3.使用自噬抑制劑后，LA3組較LA組比較，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β及IL-6水平增加，ROS水平升高，LC3Ⅱ/LC

9、3Ⅰ水平降低(P＜0.05)。
　　4.使用ULK1抑制劑后，LAS組較LA組比較，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β及IL-6水平增加，ROS水平升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低(P＜0.05)。
　　5.使用AMPK抑制劑后，LAC組較LA組比較，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β及IL-6水平增加，ROS水平升高，ULK1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　在LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞中，