煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及其增產(chǎn)煤層氣作用機(jī)理研究-畢業(yè)論文

1、<p>　　本 科 畢 業(yè) 設(shè) 計(jì)（論文）</p><p>　　題目：煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及其增產(chǎn)煤層氣作用</p><p><b>　　機(jī)理研究</b></p><p><b>　　學(xué)生姓名： </b></p><p><b>　　學(xué)號(hào)： </b></

2、p><p>　　專業(yè)班級(jí)：材料物理 </p><p><b>　　指導(dǎo)教師： </b></p><p>　　20XX年 6 月 16 日</p><p>　　中國(guó)石油大學(xué)（華東）本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）</p><p>　　煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及其增產(chǎn)煤層氣作用機(jī)理研究</p><

3、;p><b>　　摘要</b></p><p>　　本文從微生物群落結(jié)構(gòu)分析、煤層氣增產(chǎn)效果分析以及微生物對(duì)煤組分和結(jié)</p><p>　　構(gòu)的影響三方面研究了微生物增產(chǎn)煤層氣的作用機(jī)理。首先采用高通量測(cè)序技術(shù)</p><p>　　分析了煤層環(huán)境中菌群種類和豐度；其次采用氣相色譜法和氣體同位素判定法分</p><p&

4、gt;　　析了煤層氣的組分和種類；最后采用元素分析法、紅外光譜法、X 射線衍射法和</p><p>　　壓汞法分別研究了微生物對(duì)煤樣元素的種類和含量、官能團(tuán)種類、微晶結(jié)構(gòu)和孔</p><p>　　隙率的影響。研究結(jié)果表明，煤層微生物中的優(yōu)勢(shì)菌種（細(xì)菌和古菌）能夠產(chǎn)生</p><p>　　以甲烷為主的生物成因氣，且微生物的代謝作用使煤中碳含量下降、含碳官能團(tuán)</

5、p><p>　　含量下降，孔隙率增大。該研究能夠?yàn)槲⑸镌霎a(chǎn)煤層氣技術(shù)的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用提供理</p><p><b>　　論指導(dǎo)。</b></p><p>　　關(guān)鍵詞：微生物群落；煤組分；煤結(jié)構(gòu)；生物成因煤層氣</p><p>　　中國(guó)石油大學(xué)（華東）本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）</p><p>　　The res

6、earch of microbial community structure and its mechanism of producing coaled methane in coal seam</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　This article carried out the research on mechanism

7、 of microorganism producing coaled methane (CBM) in three aspects, including the analysis of microbial community structure, the effect of increasing production of CBM, and the microbial influence of the component and the

8、 structure of coal. Firstly using high-throughput sequencing technology analysed the species and abundance of bacterial communities in the coal seam; Secondly using gas chromatographic and gas isotope determination metho

9、d analysed</p><p>　　Keywords: Microbial communities；Coal composition；Coal structure；Biogenic coalbed methane</p><p>　　中國(guó)石油大學(xué)（華東）本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）</p><p>　　中國(guó)石油大學(xué)（華東）本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）</p>&

10、lt;p><b>　　參考文獻(xiàn)34</b></p><p><b>　　1 章 前言</b></p><p><b>　　1 章 前言</b></p><p>　　煤層氣是一種以甲烷為主要成分的天然氣體，又稱煤層甲烷，是煤的伴生礦</p><p>　　產(chǎn)資源，一般吸

11、附在煤層表面，少數(shù)分布于煤孔隙或溶解在煤層水中。由于煤層</p><p>　　氣是一種潔凈能源，且具有氣體輕、埋藏淺以及易于開(kāi)采、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特征，</p><p>　　近年來(lái)在國(guó)際上受到科研人員的廣泛關(guān)注。我國(guó)的煤炭資源十分豐富，采煤的同</p><p>　　時(shí)伴隨著煤層氣的釋放，因此煤層氣儲(chǔ)量也十分可觀，總量位居世界第三。然而</p><p&

12、gt;　　由于我國(guó)煤體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，煤體構(gòu)造破壞嚴(yán)重，占煤層氣資源量半數(shù)以上的“軟煤”</p><p>　　普遍發(fā)育，其滲透率僅有(10-3-10-4)×10-3 μm2 數(shù)量級(jí)[1-2]，嚴(yán)重制約了我國(guó)煤層氣</p><p>　　產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此亟需探索全新的煤儲(chǔ)層增透技術(shù)。</p><p>　　由于煤層氣按成因可分為生物成因煤層氣和熱成因煤層氣，因此目前人

13、們對(duì)</p><p>　　利用微生物降解煤生成甲烷這一觀點(diǎn)逐漸達(dá)成共識(shí)，即只要溫度、壓力、pH 值、</p><p>　　Eh 值、礦化度和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滿足微生物的生長(zhǎng)要求，就可以把煤轉(zhuǎn)化為以甲烷為</p><p>　　主的氣體[3-7]，且微生物的代謝速度與煤顆粒大小成反比，顆粒越小產(chǎn)氣效果越</p><p>　　好[8]。美國(guó)粉河盆地的煤層氣

14、開(kāi)發(fā)表明微生物對(duì)煤的轉(zhuǎn)化可以獲得持續(xù)的煤層氣</p><p>　　資源[9]，澳大利亞 Apex 公司提出向煤層中注入甲烷菌可以刺激生物氣的生成[10]。</p><p>　　這表明利用微生物對(duì)煤層氣進(jìn)行開(kāi)發(fā)和利用具有重要的意義。</p><p>　　1.1 微生物增產(chǎn)煤層氣概述</p><p>　　1.1.1 微生物增產(chǎn)煤層氣的定義<

15、/p><p>　　微生物增產(chǎn)煤層氣的概念首先由 Scott 提出[11]。他指出，在煤層中注入?yún)捬?lt;/p><p>　　微生物種群，然后加入微生物生存所需的有機(jī)物，微生物就能夠?qū)⒚褐鸩浇到猓?lt;/p><p>　　從而產(chǎn)生甲烷來(lái)達(dá)到增產(chǎn)煤層氣的效果。而且這一技術(shù)不僅能夠增加煤層氣的產(chǎn)</p><p>　　量，煤層的滲透性也能通過(guò)微生物的降解作用來(lái)增

16、加，從而解決煤層氣開(kāi)采困難</p><p><b>　　的問(wèn)題。</b></p><p>　　1.1.2 微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理</p><p>　　微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理是煤層中的微生物在一定的條件下，通過(guò)降解煤產(chǎn)</p><p>　　生以甲烷為主的氣體。煤是大分子化合物，一般來(lái)說(shuō)，生成甲烷的過(guò)程可以用傳</p&

17、gt;<p>　　統(tǒng)生物氣產(chǎn)生的機(jī)理解釋，即首先生成酸，然后產(chǎn)氫，最后生成甲烷，如圖 1-1</p><p><b>　　1</b></p><p><b>　　第 1 章前言</b></p><p>　　所示。但是相對(duì)于普通的大分子有機(jī)物，煤分子中含有氧、氮、硫等元素，是復(fù)</p><

18、p>　　雜的碳水化合物，其中含有大量的雜環(huán)、苯環(huán)和脂環(huán)，結(jié)構(gòu)更加緊密，微生物作</p><p>　　用時(shí)產(chǎn)生甲烷的難度更大。</p><p>　　圖 1-1 復(fù)雜有機(jī)質(zhì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的代謝途徑示意圖</p><p>　　因此 Strapo? 總結(jié)出了微生物通過(guò)降解煤從而增產(chǎn)煤層氣的可能途徑。降解</p><p>　　過(guò)程首先是煤大分子結(jié)

19、構(gòu)分解為小分子片段，即煤分子中共價(jià)鍵的斷裂或是官能</p><p>　　團(tuán)的破壞；然后在多種微生物的共同相互作用下生成中間代謝產(chǎn)物；再經(jīng)過(guò)微生</p><p>　　物的發(fā)酵作用后，將中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為生成甲烷所需要的底物，從而被產(chǎn)甲烷菌利用生成甲烷[12]。</p><p><b>　　2</b></p><p><b

20、>　　第 1 章前言</b></p><p>　　圖 1-2 煤的生物降解過(guò)程及中間產(chǎn)物</p><p>　　具體過(guò)程如圖 1-2 所示，“路徑 1”為煤樣經(jīng)過(guò)微生物處理過(guò)后，煤樣被降</p><p>　　解為復(fù)雜芳烴有機(jī)物、聚合物及單體化合物，其中這些復(fù)雜芳烴有機(jī)物、聚合物</p><p>　　及單體化合物被微生物的代謝

21、作用分解為帶有羧基、羥基、羰基的脂肪酸、有機(jī)</p><p>　　酸和醇類等中間產(chǎn)物；“路徑 2”表示這些中間產(chǎn)物被進(jìn)一步降解為甲烷底物（二</p><p>　　氧化碳、乙酸及氫氣等簡(jiǎn)單化合物）；“路徑 3”為甲烷底物在產(chǎn)甲烷菌的作用</p><p>　　下形成甲烷。從圖中可以看出中間產(chǎn)物種類多樣，說(shuō)明煤層甲烷的產(chǎn)生需要多種</p><p>

22、　　具有不同代謝功能的微生物參加，相互配合共同完成。</p><p>　　因此，從煤到甲烷需要經(jīng)過(guò)一系列的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，煤層甲烷的產(chǎn)生需要多種相</p><p>　　互作用的微生物參加。產(chǎn)甲烷菌不具有直接分解有機(jī)質(zhì)的能力，它主要以發(fā)酵菌</p><p>　　和產(chǎn)氫氣產(chǎn)乙酸菌分解有機(jī)質(zhì)而產(chǎn)生的 CO2、H2 和乙酸等作為碳源和能源，最</p><p&g

23、t;　　終生成甲烷。產(chǎn)甲烷古菌可分為三大類，第一類產(chǎn)甲烷古菌包括</p><p>　　Methanobacteriales、Methanococcales、Methanopyrales，多以 H2/CO2 為底物，某些成員可利用甲酸；第二類是 Methanomicrobiales，利用的底物類型與第一類產(chǎn)甲烷菌類似，有些可利用仲醇；第三類是 Methanosarcinales，具有多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，至少可以利用 9 種

24、底物，包括 H2+CO2、一氧化碳、甲醇、醋酸、甲基胺、2,3-甲</p><p><b>　　3</b></p><p><b>　　第 1 章前言</b></p><p>　　基胺以及乙基二甲基胺等。</p><p>　　1.2 國(guó)內(nèi)外煤層氣研究現(xiàn)狀</p><p>　

25、　自上世紀(jì)80年代提出生物成因氣的概念以來(lái)[13]，世界上許多國(guó)家開(kāi)始涉足</p><p>　　微生物增產(chǎn)煤層氣領(lǐng)域。利用地球化學(xué)方法，如同位素檢測(cè)、煤層氣的氣體組</p><p>　　成分析等，世界各地的生物成因煤層氣被源源不斷的檢測(cè)出來(lái)[14-16]，而且生物</p><p>　　成因煤層氣還是許多煤田煤層氣的主要來(lái)源[17-19]。由此，現(xiàn)存煤層中是否存在&l

26、t;/p><p>　　與生物成因煤層氣產(chǎn)生相關(guān)的微生物，它們的活性如何、如何作用等問(wèn)題成為</p><p><b>　　研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。</b></p><p>　　1.2.1 國(guó)內(nèi)現(xiàn)狀</p><p>　　近年來(lái)，隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)煤層中生物成因煤層氣微生物學(xué)的機(jī)理</p><p>　　有了

27、進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，煤層氣田產(chǎn)出水和煤樣中微生物的分析技術(shù)也得到了極大促進(jìn)</p><p>　　和提高。我國(guó)對(duì)微生物增產(chǎn)煤層氣的研究起步較晚，目前工作主要集中在模擬成</p><p>　　氣實(shí)驗(yàn)方面，在厭氧細(xì)菌的計(jì)數(shù)、分離、富集培養(yǎng)方面已經(jīng)取得了一定的成果，</p><p>　　但在煤地質(zhì)微生物分離上還沒(méi)有取得突破。</p><p>　　其中劉洪林等

28、人從低煤階煤層樣品中分離出來(lái)產(chǎn)甲烷菌，并發(fā)現(xiàn)其中含有的</p><p>　　產(chǎn)甲烷菌在適宜的地質(zhì)條件下能夠分解煤層產(chǎn)生甲烷氣體。蘇現(xiàn)波等人研究了微</p><p>　　生物生成甲烷的影響因素，確定了產(chǎn)甲烷的最適 pH 為 8，否則會(huì)導(dǎo)致甲烷含量</p><p>　　的減少；相比于 pH，鹽度的影響較小，但當(dāng)鹽度超過(guò)一定值時(shí)，甲烷的生成量</p><

29、;p>　　也會(huì)大幅降低[20]。此外，林海等人對(duì)產(chǎn)甲烷菌群進(jìn)行了馴化，發(fā)現(xiàn)該菌群的產(chǎn)氣</p><p><b>　　能力得到顯著提高。</b></p><p>　　在新技術(shù)的支持下，雖然取得了一定成果，但是在生物降解煤產(chǎn)甲烷方面認(rèn)</p><p>　　識(shí)仍然不足，在代謝過(guò)程中有哪些微生物參與，各微生物在代謝過(guò)程中的作用如</p>

30、;<p>　　何等問(wèn)題還需要進(jìn)一步探索。</p><p>　　1.2.2 國(guó)外現(xiàn)狀</p><p>　　在煤層微生物的研究領(lǐng)域，國(guó)外已經(jīng)有很多經(jīng)驗(yàn)，相比于國(guó)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，</p><p>　　對(duì)煤炭生物成氣過(guò)程中微生物菌群的分離培養(yǎng)及其特性研究已有較多成果，已經(jīng)</p><p>　　深入到分子化學(xué)水平。</p>

31、<p>　　Michael 等人從粉河盆地煤層氣井水樣中富集培養(yǎng)獲得了本源產(chǎn)甲烷菌，</p><p><b>　　4</b></p><p><b>　　第 1 章前言</b></p><p>　　論證了該盆地的煤層中存在活性產(chǎn)甲烷菌群，且它們可以利用煤作為主要基質(zhì)生</p><p>

32、　　產(chǎn)甲烷；并且利用 16S rRNA 序列分析，確定了不同微生物之間的進(jìn)化關(guān)系和同</p><p>　　源性[21]。Singh 等人從煤層水水樣中提取 DNA 后用古生菌和細(xì)菌的引物進(jìn)行</p><p>　　16Sr RNA 擴(kuò)增，并鑒定出有甲烷桿菌目和甲烷微菌目的微生物存在，這些微生</p><p>　　物以 H2 和 CO2 為基質(zhì)合成甲烷。熒光原位雜交(

33、fluorescence in situ hybridization，</p><p>　　FISH)技術(shù)和 16S rRNA 焦磷酸測(cè)序在煤層水微生物的研究中也得到應(yīng)用。</p><p>　　在煤層氣開(kāi)采利用方面，國(guó)外也只有少數(shù)國(guó)家進(jìn)入大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，大部</p><p>　　分都處于基礎(chǔ)研究階段，煤層氣開(kāi)發(fā)利用進(jìn)程需要進(jìn)一步加快。</p><

34、;p>　　1.3 本文研究背景及研究?jī)?nèi)容</p><p>　　通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解到，目前研究者對(duì)微生物增產(chǎn)煤層氣的探索正逐步增加，</p><p>　　對(duì)于生物成因煤層氣的定義以及生物甲烷的形成過(guò)程也有了大量研究，微生物增</p><p>　　產(chǎn)煤層氣技術(shù)正受到越來(lái)越多的關(guān)注。但是受到傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法的限制，</p><p>　　分

35、離出的微生物僅占環(huán)境樣品總數(shù)的 1% ~ 10%，不利于對(duì)煤層微生物種類的全面分析，阻礙了對(duì)煤層氣形成機(jī)理的微觀研究。</p><p>　　隨著分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用高通量測(cè)序技術(shù)可以較好地解決這一問(wèn)題。高通量測(cè)序技術(shù)是一種能夠進(jìn)行深度測(cè)試的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，它的發(fā)展極大的克服了普通分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的局限性，保證了豐度較低的物種也能正確地檢測(cè)出來(lái)，對(duì)物種的分析更加準(zhǔn)確。因此，本研究首先采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)煤層中菌

36、群的組成和豐度進(jìn)行分析，明確取樣點(diǎn)環(huán)境中存在的優(yōu)勢(shì)菌群的種類和數(shù)量，分析出煤層環(huán)境中對(duì)生物甲烷代謝起有利作用的細(xì)菌和古菌種類，為解析參與煤層有機(jī)質(zhì)降解形成甲烷的優(yōu)勢(shì)菌群提供科學(xué)依據(jù)。</p><p>　　在微生物增產(chǎn)煤層氣的作用機(jī)理方面，雖然對(duì)煤層氣的形成過(guò)程有了一定研究，但是在產(chǎn)物氣體組分分析以及微生物對(duì)煤結(jié)構(gòu)的影響方面還需進(jìn)一步研究。</p><p>　　因此，本研究?jī)?nèi)容針對(duì)微生物與煤

37、作用前后的代謝產(chǎn)物及華北油田提供的煤樣進(jìn)行煤組分和結(jié)構(gòu)分析，以明確微生物對(duì)煤層氣增產(chǎn)的影響機(jī)制。采用氣相色譜分析法對(duì)微生物作用后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，明確微生物對(duì)煤的作用程度及煤層氣的成因類型；運(yùn)用紅外光譜法測(cè)定微生物代謝后煤樣官能團(tuán)的變化；采用</p><p>　　XRD 檢測(cè)分析微生物作用后煤結(jié)構(gòu)的變化情況，以及壓汞法檢測(cè)微生物作用前</p><p>　　后煤樣孔隙率及孔徑的變化。由此總

38、結(jié)出煤層環(huán)境中的微生物群落及其對(duì)煤的作</p><p><b>　　5</b></p><p><b>　　第 1 章前言</b></p><p><b>　　用機(jī)理。</b></p><p><b>　　6</b></p><p&g

39、t;　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　要深入研究煤生物成氣的機(jī)理，必須對(duì)煤層微生物的種類進(jìn)行全面分析。高</p><p>　　通量測(cè)序技術(shù)是一種能夠進(jìn)行深度測(cè)試的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，它的發(fā)展極大的克服</p><p>　　了普通分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的局限性，保

40、證了豐度較低的物種能正確地檢測(cè)出來(lái)，大</p><p>　　量的數(shù)據(jù)也使得對(duì)物種的分析更加準(zhǔn)確。因此，本研究擬采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)</p><p>　　煤層中菌群的組成和豐度進(jìn)行分析，為解析參與煤層有機(jī)質(zhì)降解形成甲烷的優(yōu)勢(shì)</p><p><b>　　菌群提供科學(xué)依據(jù)。</b></p><p><b>　　2.

41、1 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.1.1 基因組 DNA 的提取與純化</p><p>　　高通量測(cè)序的前提是進(jìn)行 DNA 的提取與純化。高純度和高濃度的 DNA 樣</p><p>　　品能夠減少高通量測(cè)序的誤差，可以保證菌群分析結(jié)果更接近實(shí)際環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究?jī)?nèi)容針對(duì)華北油田三個(gè)時(shí)段的煤層水樣品，采用 CTAB 法進(jìn)行了 DN

42、A 的提取與純化，為菌群的豐度分析、種類分析做準(zhǔn)備。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　?。╝）抽濾裝置（b）無(wú)菌操作臺(tái)</p><p>　?。╟）瓊脂糖電泳儀（d）DNA 濃度測(cè)試儀</p><p>　　2-1 基因組 DNA 提取與純化實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>

43、;<b>　　7</b></p><p>　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)樣品</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)所用樣品為華北油田同一口井（井 Z1-312）中三個(gè)不同時(shí)段所取的煤層</p><p>　　水樣品，且保證三個(gè)時(shí)段的井內(nèi)環(huán)境相同，三個(gè)樣品分別

44、標(biāo)記為“Z1-312 2 月 20</p><p>　　日”，“Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3 月 26 日”。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p><b>　　取樣</b></p><p>　　根據(jù)取樣要求，在三個(gè)時(shí)段對(duì)煤層水樣品進(jìn)行采集，將樣品分別

45、裝入無(wú)菌</p><p><b>　　桶內(nèi)密封，靜置。</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備</b></p><p>　　主要的實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作為對(duì)實(shí)驗(yàn)用品進(jìn)行高溫滅菌處理，防止外源菌對(duì)樣品</p><p><b>　　中微生物產(chǎn)生污染。</b></p>

46、<p><b>　　抽濾</b></p><p>　?。?）將煤層采出水放于 4 ?C 層析實(shí)驗(yàn)冷柜中化凍 3-4 天；</p><p>　?。?）將全部采出水樣品倒出，放于 70 ?C 烘箱 1 h，然后分裝在 500 ml 分液漏</p><p>　　斗中進(jìn)行分液以盡可能的分離油和水；</p><p>　　

47、（3）在超凈工作臺(tái)中組裝抽濾裝置；</p><p>　?。?）使用循環(huán)水真空泵將采出水經(jīng)定性濾紙過(guò)濾，再將濾液依次經(jīng)過(guò)不同孔徑</p><p>　　濾膜，分別把濾膜裝在 50 ml 離心管中待用離心。</p><p><b>　　提取與純化 DNA</b></p><p>　?。?）濾膜加 5-7 ml SET 緩沖液用

48、勻漿機(jī)打碎，離心收集菌體；</p><p>　?。?）去掉上清液后加入一定量的緩沖液及溶菌酶，37 ?C、150 rpm/min 溫育 1 h；</p><p>　　（3）加入 23 μl 10%SDS 和 5 μl 蛋白酶 K（40 mg/ml），37 ?C、150 rpm/mim 搖</p><p><b>　　床溫育 2 h；</b>&l

49、t;/p><p>　　（4）加入 56 μl CTAB-NaCl 溶液，輕輕顛倒混勻后，65 ?C 水浴 20 min；</p><p>　?。?）加入等體積的酚：氯仿：異丙醇=25:24:1 的混合液，離心后保留有機(jī)相，如</p><p><b>　　此重復(fù)三次；</b></p><p>　?。?）將上述離心管 4 ?C、

50、11000 r/min 離心 20 min，去上清；加入 500 μl 70%冰冷乙醇洗 DNA，4 ?C、11000 r/min 離心 10 min，重復(fù)一次后，盡量吸盡管中的</p><p>　　液體，但注意不要吸到 DNA 沉淀，室溫下干燥 DNA；</p><p><b>　　8</b></p><p>　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物

51、群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　?。?）用 20-100 μl TE 緩沖液（pH=8.0）溶解 DNA；</p><p>　?。?）測(cè)定提取的 DNA 濃度。</p><p>　　2.1.2 菌群種類和豐度測(cè)定</p><p>　　菌群種類分析是對(duì)樣品中優(yōu)勢(shì)菌群的菌屬類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其目的在于明確取</p><p>　

52、　樣點(diǎn)環(huán)境中存在的優(yōu)勢(shì)菌群的種類；菌群豐度分析是為了統(tǒng)計(jì)樣品中微生物種類</p><p>　　的數(shù)量，其目的在于明確取樣點(diǎn)環(huán)境中存在的優(yōu)勢(shì)菌群的數(shù)量。本研究?jī)?nèi)容采用</p><p>　　高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)煤層水中的細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，</p><p>　　明確煤層水中細(xì)菌和古菌的種類和豐度，分析出煤層環(huán)境中對(duì)生物甲烷代謝起有</p>

53、<p>　　利作用的細(xì)菌和古菌種類。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　?。╝）高通量測(cè)序儀器（b）PCR 擴(kuò)增儀</p><p>　　圖 2-2 菌群豐度和種類測(cè)試儀器</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p&g

54、t;　　16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增和克隆文庫(kù)的構(gòu)建</p><p>　　DNA 提取與純化完成后，采用細(xì)菌 16S rDNA 擴(kuò)增通用引物 1492R（5´-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3´）和 27F（5´-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3´）進(jìn)行擴(kuò)增。采用通用引物 w017（6F，5´-ATTCYGGTTGATCCYGSCR

55、G-3´）和古菌通用引物 w002（1509R，5´-GNTACCTT GTTACGACTT-3´），進(jìn)行古菌 16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增。設(shè)置適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件進(jìn)行延伸。</p><p>　　上述 PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化、補(bǔ)平和磷酸化后，連接到 PTZ18 質(zhì)粒載體的 Smal 位</p><p>　　點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。在含有 X-gal 和氨芐青霉素

56、的 2YT 培養(yǎng)基上選擇具有</p><p>　　氨芐青霉素抗性的白色轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建 16S rDNA 文庫(kù)。</p><p>　　RFLP 酶切分型和序列測(cè)定</p><p><b>　　9</b></p><p>　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　對(duì)細(xì)菌文庫(kù)克隆進(jìn)

57、行 PCR 檢測(cè)，并選用合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行限制性內(nèi)</p><p>　　切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，篩選得到不同的多態(tài)性克隆。采用邊合成邊測(cè)序的方</p><p>　　法，對(duì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，從而得到 16S rDNA 標(biāo)簽序列。</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析</p><p>　　2.2.1 基因組 DNA 分析</p&g

58、t;<p>　　DNA 凝膠電泳圖分析</p><p>　　DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖如圖 2-3 所示。</p><p><b>　　M123M</b></p><p>　　2-3 DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖</p><p>　　2-3 中，M 代表 Loading Marker；1 代表“Z1-31

59、2 2 月 20 日”樣品；2 代表“Z1-312 3 月</p><p>　　16 日”樣品；3 代表“Z1-312 3 月 26 日”樣品。</p><p>　　圖中 3 個(gè)樣品均出現(xiàn)了 DNA 條帶，都達(dá)到了進(jìn)行高通量測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)。其中</p><p>　　1 號(hào)樣品的 DNA 條帶較弱，說(shuō)明 DNA 濃度較低；2、3 號(hào)樣品的 DNA 條帶較為</p&g

60、t;<p>　　強(qiáng)，說(shuō)明 DNA 濃度較高；3 號(hào)條帶出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，可能是由酶的質(zhì)量較差所導(dǎo)</p><p><b>　　致的。</b></p><p><b>　　DNA 濃度分析</b></p><p>　　上述各樣品的 DNA 濃度如表 2-1 所示。</p><p>　　第 2

61、 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　從表 2-1 中可以看出，“Z1-312 2 月 20 日”樣品的 DNA 濃度最低，“Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3 月 26 日”樣品的 DNA 濃度較高，與 DNA 瓊脂</p><p>　　糖凝膠電泳圖的結(jié)果一致。</p><p>　　2.2.2 群落種類和豐度分析</p&g

62、t;<p>　　如圖 2-4，圖 2-5 所示分別為各水樣中細(xì)菌和古菌在屬水平上的高通量相對(duì)</p><p>　　豐度圖。圖中的各種顏色代表一個(gè)菌屬，每種顏色條塊的高度代表該菌的相對(duì)含</p><p>　　量，因此高通量相對(duì)豐度圖能夠反映微生物的種類和相對(duì)含量。</p><p>　　圖 2-4 三個(gè)樣品中的細(xì)菌在屬水平的高通量相對(duì)豐度</p>

63、;<p><b>　　11</b></p><p>　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　圖 2-5 三個(gè)樣品中的古菌在屬水平的高通量相對(duì)豐度</p><p>　　對(duì)比三個(gè)樣品中的群落結(jié)構(gòu)可以看出，“Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3</p><p>　　26

64、日”樣品中細(xì)菌和古菌的條塊顏色較多，說(shuō)明樣品中細(xì)菌和古菌種類較多，微生物豐度較大，所以這兩個(gè)樣品微生物的群落結(jié)構(gòu)較復(fù)雜?！癦1-312 2 月 20</p><p>　　日”樣品中細(xì)菌和古菌的條塊顏色較少，說(shuō)明樣品中細(xì)菌和古菌種類較少，微生</p><p>　　物豐度較低，所以這個(gè)樣品微生物的群落結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單。</p><p>　　而且 “Z1-312 3 月 16

65、日”和“Z1-312 3 月 26 日”樣品中細(xì)菌和古菌的高</p><p>　　通量相對(duì)豐度圖顏色種類相似，但每種顏色對(duì)應(yīng)條塊的高度存在差異，表明水樣</p><p>　　的菌群種類相似而相對(duì)含量不同，即這兩個(gè)水樣的群落結(jié)構(gòu)相似。與這兩個(gè)樣品</p><p>　　相比，“Z1-312 2 月 20 日”樣品中細(xì)菌和古菌種類要少很多，說(shuō)明該水樣的細(xì)</p>

66、;<p>　　菌和古菌群落結(jié)構(gòu)與后兩個(gè)樣品的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。</p><p>　　對(duì)比圖 2-4 和圖 2-5 發(fā)現(xiàn)，在同一樣品中，古菌的高通量相對(duì)豐度圖顏色種</p><p>　　類比細(xì)菌少，這說(shuō)明在同一時(shí)段內(nèi)古菌種類少于細(xì)菌種類。</p><p>　　此外，高通量相對(duì)豐度圖中高度較大的顏色條塊代表微生物群落結(jié)構(gòu)中含量</p>&

67、lt;p>　　較多的菌種，即優(yōu)勢(shì)菌。從圖 2-4 和圖 2-5 中可以看出優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和古菌種類如下：</p><p>　　“Z1-312 2 月 20 日”樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和古菌</p><p>　　“Z1-312 2 月 20 日 ” 樣品中，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌種為硫磺單胞菌屬</p><p><b>　　12</b></p>

68、<p>　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　Sulfurospirllum （44.67%）和鼠孢菌屬 Selenomonadales (19.12%)。而古菌的群落</p><p>　　結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，且所有的古菌均為產(chǎn)甲烷古菌，其中的優(yōu)勢(shì)古菌為甲烷八疊球菌</p><p><b>　　屬。</b>&

69、lt;/p><p>　　“Z1-312 3 月 16 日”樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和古菌</p><p>　　在“Z1-312 3 月 16 日”樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中，主要的優(yōu)勢(shì)菌有厭氧繩菌</p><p>　　Anaerolineaceae_uncultured （ 15.11% ）、 Candidate_division_OD1_norank</p><

70、;p>　　（13.57%）、生絲微菌屬 Hyphomicrobium （9.43%）等。在此樣品中古菌的種類較多，其中優(yōu)勢(shì)古菌為甲烷桿菌屬（57.77%）和甲烷鬃菌屬（30.41%）。</p><p>　　“Z1-312 3 月 26 日”樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和古菌</p><p>　　在“Z1-312 3 月 26 日”樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中，主要的優(yōu)勢(shì)菌有根瘤菌</p>

71、<p>　　Rhizobium（27.49%）和鞘脂單胞菌屬 Sphingopyxis （14.73%）。“Z1-312 3 月</p><p>　　日”和“Z1-312 3 月 16 日”樣品中的古菌群落結(jié)構(gòu)相似，它們的優(yōu)勢(shì)菌也相似，為甲烷桿菌屬（56.14%）和甲烷鬃菌屬（39.93%）。</p><p>　　微生物增產(chǎn)煤層氣的原因主要是甲烷代謝細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的作用，因此

72、統(tǒng)計(jì)出樣品中有利于生物甲烷代謝的細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的種類及含量。</p><p>　　2-2 “Z1-312 2 月 20 日”樣品利于生物甲烷代謝的細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的含量</p><p><b>　　13</b></p><p>　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　表 2-3 “Z1-312

73、 3 月 16 日”樣品利于生物甲烷代謝的細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的含量</p><p>　　表 2-4 “Z1-312 3 月 26 日”樣品利于生物甲烷代謝的細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的含量</p><p>　　第 2 章煤層環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　由上述表格可知：“Z1-312 2 月 20 日”樣品中有利于生物甲烷代謝的細(xì)菌</p>&l

74、t;p>　　主要有硫磺單胞菌屬（Sulfurospirllum）和固氮螺菌屬（Azospira），古菌主要為</p><p>　　甲烷八疊球菌屬；“Z1-312 3 月 16 日”樣品中有利于生物甲烷代謝的細(xì)菌有</p><p>　　Synergistaceae_uncultured 、苯基桿菌屬（Phenylobacterium ）、硫磺單胞菌屬</p><p

75、>　　Sulfurospirllum ）和固氮螺菌屬（ Azospira ），古菌主要為甲烷桿菌屬（Methanobacterium）和甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）；“Z1-312 3 月 26 日”樣</p><p>　　品中有利于生物甲烷代謝的細(xì)菌有鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）和叢毛單胞菌科（Comamonadaceae_unclassified），古菌主要為甲烷桿菌屬（Metha

76、nobacterium）和甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）。</p><p>　　對(duì)比圖 2-4、圖 2-5 的優(yōu)勢(shì)菌種可以看出，有利于生物甲烷代謝的細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌大部分是樣品中的優(yōu)勢(shì)菌種，因此樣品中細(xì)菌和古菌的優(yōu)勢(shì)菌種對(duì)生物甲烷的生成起著重要的作用。</p><p>　　此外，三個(gè)時(shí)段的樣品中有利于生物甲烷代謝的細(xì)菌所占比例均比古菌高，說(shuō)明在生物甲烷的生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)菌起著重要的作用

77、。</p><p><b>　　2.3 本章小結(jié)</b></p><p>　　本章內(nèi)容針對(duì)華北油田煤層水樣進(jìn)行了 DNA 的提取與純化、菌群種類和</p><p>　　豐度分析等研究工作，得出結(jié)論如下：</p><p>　　三組樣品微生物群落結(jié)構(gòu)差異較明顯， “Z1-312 3 月 16 日”和“Z1-312 3 月 2

78、6 日”樣品微生物群落結(jié)構(gòu)比較相近。</p><p>　　同一樣品中古菌種類少于細(xì)菌。</p><p>　　樣品中細(xì)菌和古菌的優(yōu)勢(shì)菌種對(duì)生物甲烷的生成起著重要的作用。</p><p><b>　　15</b></p><p>　　3 章 微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　3 章

79、微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　目前，人們對(duì)微生物利用煤作為原料生成甲烷逐漸達(dá)成共識(shí)，即只要溫度、</p><p>　　壓力、pH 值、Eh 值、礦化度和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滿足微生物的生長(zhǎng)要求，就可以把煤轉(zhuǎn)</p><p>　　化為以甲烷為主的氣體，且煤顆粒越小微生物的代謝速度越快，產(chǎn)氣效果越好。</p><p>　　但目前對(duì)于微生物增

80、產(chǎn)煤層氣的作用機(jī)制尚不明確，因此，本研究?jī)?nèi)容針對(duì)微生</p><p>　　物與煤作用前后的代謝產(chǎn)物及華北油田提供的煤樣進(jìn)行煤組分和結(jié)構(gòu)分析，以明</p><p>　　確微生物對(duì)煤層氣增產(chǎn)的影響機(jī)制。</p><p>　　3.1 增產(chǎn)煤層氣效果分析</p><p>　　微生物與煤作用前后代謝產(chǎn)物分析分為氣體組分分析和氣體同位素分析兩</p

81、><p>　　部分。通過(guò)氣體組分分析，能夠測(cè)定微生物與煤作用產(chǎn)生的氣體中甲烷含量和生</p><p>　　物氣種類，明確微生物對(duì)煤的作用程度；通過(guò)氣體同位素分析，能夠明確煤層氣</p><p>　　成因的類型，進(jìn)一步了解微生物甲烷代謝的機(jī)理。</p><p>　　3.1.1 氣體組分分析</p><p>　　色譜分析法根據(jù)

82、物質(zhì)的物理性質(zhì)的不同，可以對(duì)混合物中各組分進(jìn)行分離、</p><p>　　分析，從而確定煤層氣中的組分及含量。因此本部分采用氣相色譜儀對(duì)華北油田</p><p>　　微生物作用前后的煤層氣樣品成分進(jìn)行了測(cè)定，明確生物作用煤層氣的成分和含</p><p><b>　　量。</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)

83、儀器</b></p><p>　　圖 3-1 氣相色譜儀</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)樣品</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)樣品為華北油田五口井中的煤層氣，分別在三個(gè)時(shí)間（2 月 20 日、 3</p><p>　　月 16 日、3 月 26 日）進(jìn)行取樣，采用氣相色譜法對(duì)氣樣進(jìn)行生物氣種類和含量<

84、/p><p><b>　　16</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p><b>　　分析。</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　　將分析樣品在進(jìn)樣口中氣化后，由載氣（氮?dú)猓肷?/p>

85、譜柱，通過(guò)檢測(cè)混</p><p>　　合物中的色譜柱，根據(jù)不同的保留性能使各組分分離得到檢測(cè)信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)</p><p>　　順序得到氣體組分，并且可以通過(guò)檢測(cè)峰的高度和面積得到各氣體組分的含</p><p><b>　　量。</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析</b></p&

86、gt;<p>　　2 月 20 日氣樣結(jié)果</p><p>　　2 月 20 日五個(gè)氣樣的分析結(jié)果如表 3-1 所示：</p><p>　　3-1 2 月 20 日氣樣種類和百分含量分析結(jié)果</p><p>　　由表 3-1 得，樣品生物氣種類—百分含量分析圖 3-2 如下：</p><p>　　(1) 井-1(2) 井-2

87、(3) 井-3</p><p>　　(4) 井-4(5) 井-5</p><p>　　3-2 生物氣種類—含量關(guān)系圖</p><p><b>　　17</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　從表 3-1 及圖 3-2 中可以看出，氣體由甲烷、乙

88、烷、氫氣、二氧化碳和氮?dú)饨M成。其中甲烷含量最大，為 69.67%—86.91%，氮?dú)夂看沃?，?9.36%—16.66%，二氧化碳含量第三，為 0.64%—14.95%，乙烷和氫氣的含量均較小，且氣體中不</p><p>　　含氧氣。所以該氣體主要以甲烷為主，符合煤層氣的性質(zhì)。但是通過(guò)對(duì)比五個(gè)氣</p><p>　　樣可以發(fā)現(xiàn)煤層氣樣品中甲烷含量的跨度很大，如圖 3-3 所示。</

89、p><p>　　圖 3-3 氣樣中甲烷百分含量分布圖</p><p>　　從圖 3-3 中可以看出，煤層氣中甲烷含量存在不均勻性。</p><p>　　3 月 16 日氣樣結(jié)果</p><p>　　3 月 16 日五個(gè)氣樣的分析結(jié)果如表 3-2 所示：</p><p>　　3-2 3 月 16 日氣樣種類和百分含量分析結(jié)果

90、</p><p>　　由表 3-2 得，樣品生物氣種類—百分含量分析圖 3-4 如下,</p><p><b>　　18</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　(1)井-1(2) 井-2(3) 井-3</p><p>　　(4) 井-4(5

91、) 井-5</p><p>　　圖 3-4 生物氣種類—含量關(guān)系圖</p><p>　　從表 3-2 和圖 3-4 中可以看出，3 月 16 日氣樣由甲烷、乙烷、氧氣、二氧化</p><p>　　碳和氮?dú)饨M成。氣體組分與 2 月 20 日氣樣明顯不同，氣樣組分中多了氧氣，少</p><p>　　了氫氣。除了氣體組分有變化外，氣體的含量也發(fā)生很

92、大變化。在“井-1”和“井</p><p>　　-2”樣品中，氮?dú)夂孔畲?，?72.86%和 68.75%，甲烷含量次之，為 14.38%和</p><p>　　21.89%，氧氣含量第三，為 11.75%和 8.53%，乙烷和二氧化碳含量均較低。 而</p><p>　　“井-3”、“井-4”、“井-5”樣品與 2 月 20 日氣樣相比，氣體組分雖然有變化，&l

93、t;/p><p>　　但是氣體含量變化很小。仍然是甲烷含量最高，為 93.49%—95.09%，氮?dú)夂?lt;/p><p>　　次之，為 3.41%—4.34%，乙烷、氧氣和二氧化碳含量均較低。</p><p><b>　　19</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><

94、p>　　圖 3-5 氣樣中甲烷百分含量分布圖</p><p>　　從圖 3-5 中可以看出，前二個(gè)樣品的甲烷含量很低，后三個(gè)樣品的甲烷含量</p><p>　　較高，甲烷含量存在較大的不均勻性。</p><p>　　3 月 26 日氣樣結(jié)果</p><p>　　3 月 26 日五個(gè)氣樣的分析結(jié)果如表 3-3 所示：</p>

95、<p>　　3-3 3 月 26 日氣樣種類和百分含量分析結(jié)果</p><p>　　由表 3-3 得，樣品生物氣種類—百分含量分析圖 3-6 如下。</p><p><b>　　20</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　(1)井-1(2) 井-2(3)

96、 井-3</p><p>　　(4) 井-4(5) 井-5</p><p>　　圖 3-6 生物氣種類—含量關(guān)系圖</p><p>　　從表 3-3 和圖 3-6 可以看出，3 月 26 日氣樣由甲烷、乙烷、氧氣、二氧化碳</p><p>　　和氮?dú)饨M成。與 3 月 16 日氣樣相比，氣體組分相同，氣體含量也與 3 月 16 日氣</

97、p><p>　　樣中的“井-3”、“井-4”、“井-5”樣品相似。其中，甲烷含量最大，為 95.54%—</p><p>　　97.60%，氮?dú)夂看沃瑸?1.63%—3.05，氧氣、二氧化碳和乙烷含量均較小。</p><p>　　圖 3-7 氣樣中甲烷百分含量分布圖</p><p>　　從圖 3-7 中可以看出，3 月 26 日樣品的甲烷含量

98、均較高，且比較均勻。</p><p><b>　　21</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　而且通過(guò)對(duì)比三組氣樣中的甲烷含量可以看出，隨微生物作用時(shí)間的增長(zhǎng)，</p><p>　　甲烷含量增加。說(shuō)明微生物增產(chǎn)煤層氣是一個(gè)持續(xù)的長(zhǎng)期的過(guò)程。</p><

99、p>　　3.1.2 氣體同位素分析</p><p>　　由于煤的成分和結(jié)構(gòu)受到微生物或熱力作用的影響會(huì)發(fā)生變化，并且有烴類</p><p>　　氣體的形成。而在不同階段，不同成因類型的烴類氣體具有不同的同位素特征。</p><p>　　其中生成的烴類氣體基本都含有甲烷，而甲烷的碳同位素組成與其成因密切</p><p>　　相關(guān)，因此可以

100、用甲烷的 13C 同位素特征來(lái)有效地判斷烴類來(lái)源，從而確定煤層</p><p><b>　　氣的成因。</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　　Precon-GC/C-IRMS 聯(lián)用系統(tǒng)。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)樣品</b></

101、p><p>　　本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)提供的三個(gè)時(shí)間（2 月 20 日、 3 月 16 日、3 月 26 日）下的</p><p>　　五口井中的氣樣進(jìn)行了檢測(cè)。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　?。?） 使用真空收集瓶收集大氣樣，待測(cè)；</p><p>　?。?） 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)

102、；</p><p>　?。?） 對(duì)收集到的 CH4 進(jìn)行富集濃縮，收集空氣樣中 CH4 燃燒產(chǎn)生的 CO2；</p><p>　　（4） CO2 進(jìn)入微直徑液氮冷阱(-1960C)進(jìn)行凈化、濃縮和提純，并經(jīng) GC 進(jìn)</p><p>　　一步分離純化，以高純 CO2 為工作參考?xì)?，在線進(jìn)行 CH4 碳同位素</p><p><b>

103、　　測(cè)定。</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析</b></p><p>　　煤層氣成因分為三種類型：1、生物成因煤層氣：由各類微生物的一系列復(fù)雜作用過(guò)程導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)發(fā)生降解作用而形成的。2、熱成因煤層氣：煤分子結(jié)構(gòu)與成分隨溫度升高發(fā)生變化而形成的烴類氣體。3、混合成因煤層氣：由各種作</p><p><b>　

104、　用復(fù)合產(chǎn)生。</b></p><p>　　一般根據(jù)甲烷碳同位素組成(δ13C)來(lái)判識(shí)生物成因氣類型，國(guó)際上認(rèn)為δ13C<-55‰為生物成因氣，-55‰~-44.5‰為混合成因氣，-42‰~-16.7‰為熱成因</p><p><b>　　氣。</b></p><p>　　因此通過(guò)對(duì) 15 個(gè)氣樣的檢測(cè)，對(duì)煤層氣的成因做出了細(xì)

105、致分析，檢測(cè)結(jié)果</p><p><b>　　22</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　如表 3-4 所示：</p><p>　　表 3-4 甲烷 13C 同位素分析結(jié)果</p><p>　　從表 3-4 中可以看出 δ13C 含量在-60.33

106、‰ ~ -55.53 ‰之間，均滿足 δ13C<-55‰ 的條件，所以 15 份氣樣均為生物成因煤層氣。</p><p>　　3.2 微生物對(duì)煤組分和結(jié)構(gòu)的影響</p><p>　　本研究?jī)?nèi)容針對(duì)華北油田提供的煤樣進(jìn)行了煤組分和結(jié)構(gòu)分析，以明確微生</p><p>　　物對(duì)煤組分和結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制。</p><p>　　3.2.1 煤樣品

107、組分分析</p><p>　　在微生物對(duì)煤組分影響的研究中，重點(diǎn)分析了微生物對(duì)煤元素和官能團(tuán)的影</p><p>　　響規(guī)律。因此，本研究?jī)?nèi)容采用元素分析儀測(cè)定了微生物代謝前后煤樣元素的變</p><p>　　化情況，明確微生物對(duì)煤樣元素的影響；采用紅外光譜測(cè)定了微生物代謝前后煤</p><p>　　樣官能團(tuán)的變化情況，明確微生物對(duì)煤樣官能團(tuán)

108、的影響。</p><p>　　3.2.1.1 煤樣元素分析</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)原理</b></p><p>　　樣品經(jīng)預(yù)熱后，在高純氧環(huán)境中被氧化為 H2O、CO2、N2 及少量 NOx，其中</p><p>　　碳?xì)湓氐暮坑杉t外吸收法測(cè)定。氮元素的測(cè)量則是在去除氧氣后，將氮氧化</p>

109、<p>　　物還原為 N2，吸收掉 CO2、H2O 后，測(cè)出 N2 的濃度并換算成所測(cè)樣品中 N 元素</p><p><b>　　的含量。</b></p><p><b>　　23</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p><b>　　

110、實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　　3-8 5E-CHN2000 元素分析儀</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　?。?） 煤樣測(cè)試前，首先進(jìn)行空白較正和儀器校準(zhǔn)試驗(yàn)，待儀器各參數(shù)修正后，</p><p><b>　　再檢測(cè)樣品。</b></p>

111、<p>　?。?） 稱取 0.29g 研細(xì)混勻的分析煤樣于錫箱杯中，置于自動(dòng)進(jìn)樣器的相應(yīng)位置，輸入質(zhì)量，按分析鍵，樣品自動(dòng)落入燃燒管內(nèi)增鍋中。</p><p>　　（3） 4 min 后顯示結(jié)果并打印。</p><p>　?。?） 每一煤樣應(yīng)重復(fù)測(cè)定兩次，將兩次結(jié)果取平均即為所得值。且其平行測(cè)試</p><p>　　結(jié)果的差值需滿足國(guó)標(biāo) GB476-9

112、1 的有關(guān)規(guī)定，即兩次結(jié)果差值 Cad <</p><p>　　0.50%、Had < 0.15% 、Nad < 0.08%，否則需補(bǔ)測(cè)。</p><p>　?。?） 注意在樣品結(jié)果處理時(shí)應(yīng)扣除內(nèi)在水分的影響。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析</b></p><p>　　煤樣組分分析采用元素

113、分析儀對(duì) 10 個(gè)煤樣（其中 5 個(gè)塊狀煤樣、5 個(gè)粉末煤樣、2 個(gè)無(wú)規(guī)則塊煤）進(jìn)行元素分析，分析結(jié)果如下：</p><p><b>　　24</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　表 3-5 煤樣元素分析</p><p>　　注：表中“KM1”、“KM2”為未經(jīng)微生物

114、處理的煤樣； FM 系列為微生物處理后的粉末狀煤樣；KM 系列為微生物處理后塊狀的煤樣。</p><p>　　從表 3-5 中可以看出，與“KM1”和“KM2”（未經(jīng)微生物處理的樣品）相比，就整體而言，微生物作用后粉末煤樣（FM 系列）中 N、H 含量上升，C、S 含量下降，且 C 元素含量下降幅度較大。而塊狀煤樣（KM）則無(wú)明顯規(guī)</p><p>　　律。說(shuō)明微生物作用于煤生產(chǎn)甲烷還與煤

115、顆粒大小有關(guān)。</p><p>　　其中 C 含量下降是因?yàn)槲⑸飳⒚褐鸩浇到?，產(chǎn)生甲烷，消耗的 C 元素越多產(chǎn)甲烷越多，說(shuō)明煤顆粒越小微生物的代謝速度越快。H 含量上升表明氫化</p><p>　　水解作用的發(fā)生，煤中高聚物的鍵被打斷，使其更容易受到菌類代謝產(chǎn)生的溶</p><p>　　煤活性物的攻擊而發(fā)生溶解。</p><p>　　3.2

116、.1.2 煤樣官能團(tuán)分析</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　　3-9 Fourier 變換紅外光譜儀（FTIR 儀）</p><p><b>　　25</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p><b

117、>　　實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　?。?） 稱取 1 mg 的研究煤樣進(jìn)行研磨。</p><p>　　（2） 研磨充分后加入約 150 mg 溴化鉀繼續(xù)研磨。</p><p>　?。?） 然后將與溴化鉀混合均勻的待測(cè)樣品在 30 MPa 的壓力下制成直徑 13</p><p><b>　　的薄片。</

118、b></p><p>　?。?） 將樣品放在傅里葉變換紅外光譜儀上完成測(cè)定。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析</b></p><p>　　微生物作用前后煤樣的紅外光譜結(jié)果分析，如圖 3-10 所示：</p><p>　　3-10 微生物作用前后煤樣紅外光譜圖</p><p>　　注

119、：a：芳烴；b：醚基(C-O-C)；c：羥基(R-OH)。</p><p>　　根據(jù)紅外光譜圖和官能團(tuán)吸收峰歸屬表，可以對(duì)樣品中的官能團(tuán)進(jìn)行定性和</p><p>　　定量的分析。根據(jù)吸收峰峰位，可以判斷官能團(tuán)類型；根據(jù)吸收峰峰高，可以大</p><p>　　致判斷官能團(tuán)的相對(duì)含量。</p><p>　　根據(jù)圖 3-10 微生物作用前后紅外光

120、譜圖對(duì)比分析，可以得到：微生物作用</p><p>　　后，煤樣中芳烴含量下降，醚基含量上升，羥基含量上升。說(shuō)明微生物代謝使煤</p><p>　　中含氧官能團(tuán)含量上升，含碳官能團(tuán)含量下降。微生物有可能是通過(guò)生物代謝作</p><p>　　用氧化碳碳雙鍵引入氧，形成醚基或羥基的方式，實(shí)現(xiàn)微生物對(duì)煤的降解。</p><p><b>　

121、　26</b></p><p>　　第 3 章微生物增產(chǎn)煤層氣的機(jī)理研究</p><p>　　3.2.2 煤樣結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　在微生物對(duì)煤樣結(jié)構(gòu)影響的研究中，重點(diǎn)考察了微生物對(duì)煤大分子結(jié)構(gòu)和孔</p><p>　　隙率的影響。本研究?jī)?nèi)容采用 XRD 測(cè)定了微生物代謝前后煤樣微晶結(jié)構(gòu)參數(shù)的</p>&l

122、t;p>　　變化情況，明確了微生物對(duì)煤樣微晶結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響；采用壓汞法測(cè)定了微生物</p><p>　　代謝前后煤孔隙率的變化情況，明確了微生物對(duì)煤孔隙率的影響。</p><p>　　3.2.2.1 煤大分子結(jié)構(gòu)分析</p><p>　　為了深入研究不同煤化程度煤的結(jié)構(gòu)特征，本部分用 X 射線衍射方法對(duì)煤</p><p>　　樣進(jìn)行分析

123、，從而得到煤的微晶參數(shù)數(shù)據(jù)。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)原理</b></p><p>　　通過(guò)對(duì)材料進(jìn)行 X 射線衍射，可以分析其衍射圖譜，獲得材料的成分、材料</p><p><b>　　內(nèi)部結(jié)構(gòu)及形態(tài)等。</b></p><p>　　圖 3-11 布拉格衍射示意圖</p>&

124、lt;p>　　由布拉格公式及所測(cè)得的 d002、半峰寬值及衍射角 2值可以算出 La 和 Lc 的</p><p><b>　　值。</b></p><p>　　式中：La 為層片延展度；Lc 為層片堆砌度；θ 為 X 射線衍射角；</p><p>　　為 X 射線波長(zhǎng)，λ=0.154178 nm；β 為衍射峰半寬高；</p>