雌性牙鲆性激素合成酶相關(guān)基因SNP和DNA甲基化與繁殖內(nèi)分泌相關(guān)性研究.pdf

1、本文以人工要養(yǎng)殖雌性牙鲆（Paralichthys olivaceus）為研究對(duì)象，首次分析了cyp-17Ⅱ基因甲基化位點(diǎn)的突變對(duì)其基因表達(dá)和繁殖內(nèi)分泌的影響機(jī)理；并對(duì)cyp17-Ⅱ、Cyp19、Foxl2基因啟動(dòng)子和編碼區(qū)CpG富集區(qū)（CpG rich region）在性腺發(fā)育期的甲基化模式對(duì)基因表達(dá)和繁殖性狀的影響進(jìn)行了研究和分析。
　　1、cyp-17Ⅱ基因甲基化位點(diǎn)的突變對(duì)其基因表達(dá)和繁殖內(nèi)分泌的影響機(jī)理
　　細(xì)胞色

2、素P450c17-Ⅱ（cyp17-Ⅱ）是影響魚類生長，性腺分化和發(fā)育等繁殖性狀的重要因子。牙鲆cyp17-Ⅱ基因編碼區(qū)有三個(gè)CpG富集區(qū)。本文的目的是研究cyp17-Ⅱ外顯子的突變是否發(fā)生在CpG位點(diǎn)上，以及這些CpG位點(diǎn)的突變和甲基化水平是否參與調(diào)控牙鲆cyp17-Ⅱ基因表達(dá)和繁殖內(nèi)分泌。結(jié)果顯示：檢測到三個(gè)單核苷酸多態(tài)性，分別是：SNP1：[(c.G594A（p.Gly188Arg）]在外顯子4上，稱為L1位點(diǎn)（L1 locus）；

3、SNP2（c.A939G）和SNP3（c.C975T），位于cyp17-Ⅱ基因外顯子6的CpG富集區(qū)，稱為L2位點(diǎn)（L2 locus）。此外，在939bp位置A→C的轉(zhuǎn)變使cyp17-Ⅱ編碼區(qū)增加了一個(gè)新的甲基化位點(diǎn)。通過多重比較分析，兩個(gè)位點(diǎn)（L1 locus和L2 locus）都與卵巢中睪酮（T）水平（P<0.05）和cyp17-Ⅱ表達(dá)（P<0.01）顯著相關(guān)。有趣的是，GG型個(gè)體在L2位點(diǎn)包含8個(gè)CpG甲基化位點(diǎn)與包含7個(gè)甲基化位

4、點(diǎn)的AA型的個(gè)體相比，具有較低的睪酮水平和cyp17-Ⅱ mRNA表達(dá)含量。而且，GG型個(gè)體在938bp位置高度甲基化（≥77.8％）。這些暗示cyp17-Ⅱ編碼區(qū)突變和甲基化水平可能影響雌性牙鲆基因表達(dá)和繁殖內(nèi)分泌水平，并且，L2位點(diǎn)可以作為牙鲆育種的一個(gè)候選基因或遺傳標(biāo)記。
　　2、牙鲆卵巢發(fā)育期內(nèi)cyp17-Ⅱ的甲基化水平與基因表達(dá)水平及繁殖性狀相關(guān)性分析
　　在魚類中細(xì)胞色素P450c17-Ⅱ（cyp17-Ⅱ,17α

5、-羥化酶）參與卵泡成熟過程中類固醇激素的產(chǎn)生。繁殖周期中cyp17-Ⅱ基因的相對(duì)表達(dá)模式將有助于闡釋其在性腺發(fā)育中的功能。此外，表觀遺傳修飾特別是DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)調(diào)控起重要作用。本實(shí)驗(yàn)以成年雌性牙鲆為研究對(duì)象，采用熒光實(shí)時(shí)定量測定牙鲆性腺cyp17-Ⅱ基因的相對(duì)表達(dá)量，并檢測性腺指數(shù)（GSI）、雌二醇、睪酮等繁殖生理指標(biāo)。運(yùn)用亞硫酸測序法測定位于編碼區(qū)外顯子4和6上的CpG二核苷酸甲基化水平。在性腺發(fā)育早期，cyp17-Ⅱ基因具有

6、較低的表達(dá)水平，但最后升高。同時(shí)，睪酮和雌二醇的變化趨勢與cyp17-Ⅱ基因表達(dá)趨勢相一致。相反，性腺中cyp17-Ⅱ基因在每個(gè)CpG富集區(qū)整體甲基化水平從Ⅱ期到Ⅳ下降，然后升高，其變化趨勢與性腺中基因表達(dá)、睪酮和雌二醇以及GSI相反?；诒狙芯?，提出cyp17-Ⅱ可能調(diào)節(jié)雄激素和雌激素水平，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞生長與成熟，并且cyp17-Ⅱ基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能受編碼區(qū)CpG富集區(qū)甲基化水平的影響。這些結(jié)果將有利于研究魚類繁殖內(nèi)分泌的分子調(diào)控

7、機(jī)制。
　　3、牙鲆卵巢發(fā)育期內(nèi)cyp19、Foxl2基因的甲基化水平與基因表達(dá)水平及繁殖性狀相關(guān)性分析
　　本實(shí)驗(yàn)研究了性腺中對(duì)雌激素合成具有重要作用，并存在上下游調(diào)控關(guān)系的Foxl2基因和Cyp19a基因，從表觀遺傳學(xué)角度闡釋Foxl2對(duì)Cyp19a基因的調(diào)控機(jī)制，以及這兩種基因在卵巢發(fā)育周期中的表達(dá)機(jī)理。通過相對(duì)熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)Foxl2基因和Cyp19a基因均隨卵巢發(fā)育期呈相同變化規(guī)律，即在Ⅱ期表達(dá)量相對(duì)較低，隨后在

8、Ⅲ期和Ⅳ期不斷上升并達(dá)到最高之后在Ⅴ出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。運(yùn)用亞硫酸氫鹽修飾后測序法檢測Cyp19a基因啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)外顯子1區(qū)域的CpG富集區(qū)甲基化模式，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)的9個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平隨性腺發(fā)育呈現(xiàn)出與基因表達(dá)相反的變化趨勢；其中-223bp位置的CpG二核苷酸位于cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白識(shí)別序列，-141bp位置的CpG二核苷酸位于Ad4結(jié)合蛋白（Ad4BP）識(shí)別序列；而外顯子1區(qū)域的CpG富集區(qū)的11個(gè)甲基化位

9、點(diǎn)的甲基化水平變化趨勢也與基因表達(dá)趨勢成負(fù)相關(guān)性，其中有7個(gè)可能位于假定的轉(zhuǎn)錄因子的相應(yīng)結(jié)合序列上。根據(jù)DNA高甲基化水平會(huì)抑制基因表達(dá)的原理，我們推測位于Cyp19a基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用原件識(shí)別序列上的CpG位點(diǎn)的甲基化模式可能會(huì)改變轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合的效率，從而改變基因轉(zhuǎn)錄效率。Foxl2可以通過直接結(jié)合到Cyp19a基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合序列上或者通過先與Ad4結(jié)合蛋白相結(jié)合然后再結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)的Ad4結(jié)合蛋白的識(shí)別序列上調(diào)控Cyp1

10、9a基因表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還檢測了Foxl2基因編碼區(qū)3個(gè)CpG富集區(qū)（依次命名為F1、F2和F3）的甲基化模式，發(fā)現(xiàn)其總甲基化概率與其基因表達(dá)成負(fù)相關(guān)性，這表明Foxl2基因本身的轉(zhuǎn)錄效率受其CpG富集區(qū)甲基化模式調(diào)控。此外，F(xiàn)oxl2基因保守區(qū)FH區(qū)域（fork head domain，F(xiàn)HD）位于F1和F2上，F(xiàn)HD對(duì)于Foxl2準(zhǔn)確結(jié)合到目標(biāo)基因至關(guān)重要，因此推測FHD上的CpG位點(diǎn)的甲基化模式的變化可能會(huì)影響其與靶基因的結(jié)合效率?？?/p>

11、之，通過本文的研究我們可以推測出Foxl2通過其FDH結(jié)合到Cyp19a啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控Cyp19a基因的表達(dá)；另外，F(xiàn)oxl2和Cyp19a基因轉(zhuǎn)化效率也可能受其本身CpG富集區(qū)甲基化模式的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為闡釋Foxl2調(diào)控Cyp19a的調(diào)控機(jī)制提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)，進(jìn)一步揭示出Cyp19a和Foxl2基因?qū)Υ菩匝丽倚韵侔l(fā)育起重要作用。
　　綜上所述，本研究對(duì)牙鲆cyp17-Ⅱ基因編碼區(qū)SNP進(jìn)行檢測，并對(duì)cyp17-