左歸丸對(duì)破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL表達(dá)的影響.pdf

1、目的：采用成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞培養(yǎng)的方法，從破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL變化的角度，部分揭示左歸丸治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，并為中醫(yī)“腎主骨”機(jī)理的研究提供科學(xué)依據(jù)。 方法：1左歸丸含藥血清的制備將15只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、卵巢切除(OVX)組、OVX加左歸丸組，每組5只。 OVX組和OVX加左歸丸組：摘除這兩組大鼠的雙側(cè)卵巢。在術(shù)后3個(gè)月，OVX加左歸丸組大鼠灌服左歸丸，一日2次，連續(xù)

2、5次，于末次給藥后1h，乙醚麻醉，無(wú)菌條件下，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，冷置1h后，離心(2500r/min,25min)，分離血清，是為含藥血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?OVX組和正常對(duì)照組按以上程序，灌服等容積的蒸餾水，所取血清分別為OVX組血清和正常對(duì)照組血清。 2破骨細(xì)胞所致骨吸收陷窩數(shù)目及面積的檢測(cè)2.1成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共同培養(yǎng)在超凈臺(tái)內(nèi)對(duì)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行改裝，在培養(yǎng)孔側(cè)壁中部打孔，使相鄰的兩孔相通：其中一孔為成骨

3、細(xì)胞培養(yǎng)室，另一孔為破骨細(xì)胞培養(yǎng)室，紫外線照射2h，做共培養(yǎng)用。 取第3代生長(zhǎng)良好的成骨細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，以終濃度1×104/ml接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的成骨細(xì)胞培養(yǎng)室，24h后細(xì)胞已牢固貼于孔底，然后將吸附破骨細(xì)胞的骨片加入破骨細(xì)胞培養(yǎng)室，置37℃，5﹪CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)。 2.2分組及含藥血清的添加本實(shí)驗(yàn)分為6組：破骨細(xì)胞(OC)+正常血清組、OC+OVX血清組、OC+OVX含藥血清組、OB+OC+正常血清組、O

4、B+OC+OVX血清組、OB+OC+OVX含藥血清組，每組有8個(gè)樣本，即每組有8張骨片。OC+正常血清組、OC+OVX血清組及OC+OVX含藥血清組中的破骨細(xì)胞，在骨片上培養(yǎng)24h后，更換為含10﹪各組血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每24h換液1次。OB+OC+正常血清組、OB+OC+OVX血清組及OB+OC+OVX含藥血清組，如2.1所述，將成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，亦于培養(yǎng)24h后更換為含10﹪各組血清的培養(yǎng)液，并每隔數(shù)小時(shí)將培養(yǎng)板傾斜1

5、次，以促進(jìn)雙側(cè)上清交流，每24h換液1次。7d后取出骨片，在0.25mol/l氫氧化氨中超聲清洗5min×3次，梯度乙醇脫水，室溫晾干，1﹪甲苯胺藍(lán)室溫染色4min-6min，蒸餾水清洗后光鏡下觀察。 在光鏡100倍下，對(duì)整張骨片進(jìn)行陷窩計(jì)數(shù)，結(jié)果以陷窩數(shù)/骨片表示；并在200倍下，用Leica圖像分析系統(tǒng)計(jì)算骨吸收陷窩的面積。 3成骨細(xì)胞OPG、RANKL蛋白和mRNA表達(dá)的檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)分為3組：成骨細(xì)胞(OB)+正常血

6、清組、OB+OVX血清組、OB+OVX含藥血清組，每組8個(gè)樣本。取第3代成骨細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，將細(xì)胞懸液以終濃度1×104/ml接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)置多聚賴氨酸處理的無(wú)菌蓋玻片)，24h后更換為含10﹪各組血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)72h后取出蓋玻片，PBS沖洗3次，免疫細(xì)胞化學(xué)染色所用標(biāo)本用丙酮固定10min，室溫晾干，-20℃保存?zhèn)溆?；原位雜交檢測(cè)所用標(biāo)本用4﹪多聚甲醛/0.1MPBS(PH：7.4)，含有1/1000DEPC，室溫固定15m

7、in，蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩?采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色與原位雜交方法，分別檢測(cè)OPG、RANKL蛋白和mRNA在成骨細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，用Leica圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野(光鏡下放大×100)，測(cè)定表達(dá)的強(qiáng)度，經(jīng)換算后以平均光密度值(MOD)表示。4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，組間兩兩比較，采用q檢驗(yàn)。 結(jié)果：1左歸丸含

8、藥血清對(duì)破骨細(xì)胞所致骨吸收陷窩數(shù)目及面積的影響各組在培養(yǎng)的第1d，骨片上出現(xiàn)了少量的骨吸收陷窩，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸收陷窩數(shù)目不斷地增多、面積不斷擴(kuò)大。在培養(yǎng)的第7d，OC+OVX血清組骨吸收陷窩數(shù)目及面積顯著高于OC+正常血清組；OC+OVX含藥血清組骨吸收陷窩數(shù)目及面積與OC+OVX血清組相比，顯著降低，但仍明顯高于OC+正常血清組。與OC+OB+正常血清組相比，OC+OB+OVX血清組骨吸收陷窩數(shù)目及面積顯著增高；OC+OB+O

9、VX含藥血清組與OC+OB+OVX血清組相比，明顯降低，而與OC+OB+正常血清組比，無(wú)顯著性差異。與OC+OVX血清組相比，OC+OB+OVX血清組骨陷窩顯著增多；而OC+OB+OVX含藥血清組與OC+OVX含藥血清組相比，骨陷窩數(shù)目及面積明顯減少。見(jiàn)表1。 表1各組破骨細(xì)胞所致骨吸收陷窩數(shù)目與面積的變化組別數(shù)目(個(gè))面積(μm2×102)OC+正常血清組219.13±33.07698.78±60.49OC+OVX血清組332

10、.75±29.29**997.08±78.57**OC+OVX含藥血清組277.13±29.37**△△845.09±94.54**△△OC+OB+正常血清組231.38±26.00716.44±50.78OC+OB+OVX血清組385.25±30.57＃＃△△1105.16±99.47＃?！鱋C+OB+OVX含藥血清組245.00±28.89▲▲☆745.74±61.44▲▲☆注：與OC+正常血清組比較：**P＜0.01；與OC+OV

11、X血清組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01；與OC+OB+正常血清組比較：＃＃P＜0.01；與OC+OB+OVX血清組比較：▲▲P＜0.01；與OC+OVX含藥血清組比較：☆P＜0.052左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞OPG、RANKL蛋白和mRNA表達(dá)的影響2.1左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞OPG蛋白和mRNA表達(dá)的影響 OB+OVX血清組成骨細(xì)胞OPG蛋白和mRNA表達(dá)的MOD值與OB+正常血清組相比，顯著降低；與OB+OVX血清

12、組相比，OB+OVX含藥血清組MOD值明顯升高，而與OB+正常血清組相比，無(wú)顯著性差異。這一結(jié)果說(shuō)明，OB+OVX血清組成骨細(xì)胞OPG蛋白和mRNA的表達(dá)與OB+正常血清組相比，顯著減弱；OB+OVX含藥血清組成骨細(xì)胞OPG蛋白和mRNA的表達(dá)與OB+OVX血清組相比，明顯增強(qiáng)，而與OB+正常血清組相比，無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表2。 表2各組成骨細(xì)胞OPG蛋白和mRNA表達(dá)MOD值的變化OPG蛋白表達(dá)OPGmRNA表達(dá)組別(MOD)(

13、MOD)OB+正常血清組0.171±0.0360.168±0.031OB+OVX血清組0.128±0.023*0.125±0.027**OB+OVX含藥血清組0.159±0.031△0.155±0.025△注：與OB+正常血清組比較：**P＜0.01；與OB+OVX血清組比較：△P＜0.052.2左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞RANKL蛋白和mRNA表達(dá)的影響與OB+正常血清組相比，OB+OVX血清組成骨細(xì)胞RANKL蛋白和mRNA表達(dá)的MO

14、D值明顯升高；OB+OVX含藥血清組與OB+OVX血清組比較，MOD值明顯降低，而與OB+正常血清組比較，無(wú)顯著性差異。這一結(jié)果說(shuō)明，OB+OVX血清組成骨細(xì)胞RANKL蛋白和mRNA的表達(dá)比OB+正常血清組明顯增強(qiáng)；與OB+OVX血清組相比，OB+OVX含藥血清組RANKL表達(dá)明顯減弱，而與OB+正常血清組相比，無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表3。 表3各組成骨細(xì)胞RANKL蛋白和mRNA表達(dá)MOD值的變化RANKL蛋白表達(dá)RANKLmRN

15、A表達(dá)組別(MOD)(MOD)OB+正常血清組0.130±0.0340.126±0.028OB+OVX血清組0.167±0.029*0.168±0.034*OB+OVX含藥血清組0.135±0.030△0.135±0.025△注：與OB+正常血清組比較：*P＜0.05；與OB+OVX血清組比較：△P＜0.05結(jié)論左歸丸含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞活性有明顯的抑制作用。其作用是通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。具體途徑是